猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株orf7基因的原核表达及elisa方法的建立

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株0RF7基因的原核表达及ELISA方法的建立学位申请人:孙明潭指导教师：孙继国教授袁万哲副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇_五年五月二十四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过

2、的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河j匕农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名导师签名：府签字闩期年j�月•签字円期：八丨丁年j月讲R学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:扁通

3、讯地址:分类号：S851.34单位代码：10086密级：公开学号：2012358猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF7基因的原核表达及ELISA方法的建立ExpressionandpurificationofNgeneofPRRSVisolatefromHebeiandEstablishmentofN-ELISA学位申请人：孙明潭指导教师：孙继国教授袁万哲副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandres

4、piratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状的传染病，又称猪蓝耳病。PRRS已成为当前困扰中国养猪业健康发展的主要烈性传染病之一。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株，通过与Genbank上发表的核苷酸和氨基酸序列进行对比，了解河北PRRSV的分子流行病学特点。以本地分离株为基础，克隆表达编码PRRS病毒粒子中含量最多、免疫原性最强蛋白的ORF7基因，构建成熟

5、的原核表达系统，并将表达的N蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。本研究从河北省多地送检的疑似PRRS阳性病料进行RT-PCR鉴定，将确诊的阳性病料接种Marc-145细胞，然后连续传代。其中河北新乐市送检病料接种Marc-145细胞后经过5代盲传后，出现典型细胞病变(CPE)，初步分离到一株病毒，暂命名为PRRSVHB-XL株。进一步对其ORF5与NSP2基因克隆测序，经同源性比较及系统进化树等分析，表明该毒株ORF5与NSP2基因与国内流行的缺失变异株遗传关系较近，与国内外经典美洲型毒株及基因重组毒株QYYZ遗传关系较远

6、且与欧洲型LV毒株处于不同分支；ORF5基因编码的200个氨基酸的第13位、151位均为具有强毒特性的精氨酸（R），第137位为具有野毒特性的丝氨酸（S）；与经典美洲株相比，该毒株NSP2基因分别发生3个碱基和87个碱基的不连续缺失。说明HB-XL株属于美洲型PRRSV并存在不断变异的趋势。设计1对添加酶切位点的特异性引物扩增PRRSVHB-XL株的ORF7全基因，并与原核表达载体pET-32a连接，构建ORF7基因的原核表达系统pET-32a-N；将重组质粒转化入BL21感受态细胞，经IPTG的诱导表达，SDS-PAGE可检

7、测到分子质量约为34.0kDa的目的蛋白；经Western-blotting分析，表明该重组蛋白具有良好的免疫原性；并对表达条件进行了优化，结果表明在诱导时间为4h，IPTG浓度1.5mM，诱导温度为37℃的条件下目的蛋白表达量最大。将表达纯化后的N蛋白作为包被抗原，按一定的稀释度倍比稀释。采集PRRSV阳性猪血清，按一定稀释度倍比稀释。测定各步骤反应的条件，成功建立ELISA方法。重组抗原包被浓度为2.23μg/ml，37℃1h或者4℃过夜；封闭液为2%的明胶，37℃封闭1h；血清1:80稀释，37℃作用1h；酶标二抗1:1

8、000稀释，37℃作用40min；底物（TMB）室温显色15min；若检测的OD450>0.363则为阳性，若检测的OD450<0.34则为阴性。该方法与商业化的美国IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒的符合率为91.6%，其中相对敏感性为92.3%，相对特异性为90.4%，结