牛传染性鼻气管炎病毒sh7株gb、gd基因的原核表达及elisa方法的建立

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateProkaryoticExpressionofInfectiousBovineRhinotracheitisVirusSH7IsolateGlycoproteinBandGlycoproteinDandEstablishmentofELISAMethodsCandidate:FeiWeiyanSupervisor:Prof.WangGuijunRrof.ZhangKechunAcademicdegreeappliedfor:MasterofveterinarymedicineSpecia

2、lity:VeterinarymedicineResearchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:AnimalScienceandTechnologyCollegeMay,2015项目基金1.上海市科委上海市产业技术创新战略联盟项目，上海市优质原料奶产业技术创新战略联盟（13DZ0510900）摘要牛传染性鼻气管炎（InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR）是由疱疹病毒科（Herpesviridae）甲疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）中的牛传染性鼻气管炎病毒（InfectiousBo

3、vineRhinotracheitisVirus,IBRV）引起的牛的一种接触性传染病。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为B类疫病，是我国入境动物及国际动物贸易的重点检疫疫病。目前，gB、gD蛋白是IBRV检测的首选蛋白。本研究从前期分离的IBRVSH7株的gB、gD基因入手，旨在通过与已发表的国内外IBRV经典株进行比较，确定IBRVSH7株与上述经典株的同源关系。扩增出了大小分别为2802bp、1254bp的gB、gD基因序列。在同源性比较中，IBRVSH7株的gB、gD基因序列与瑞士BHVCooper株（GenBank：Z78205.1）的gB、gD基因的同源性均为100%。通过对gB

4、、gD基因序列的分析，扩增出了大小分别为1461bp和1005bp的目的片段。将新扩增的gB、gD目的基因片段分别克隆至原核表达载体pColdⅡ和pET-28a中，成功构建了原核表达重组质粒pColdⅡ-gB和pET-28a-gD；转入BL21（DE3）感受态细胞后，用IPTG诱导表达，Ni柱亲和层析纯化法对蛋白进行纯化。SDS-PAGE结果表明，重组pColdⅡ-gB蛋白以包涵体形式表达，相对分子质量约为55.7kDa；重组pET-28a-gD蛋白以可溶形式表达，相对分子质量约为40.6kDa。纯化的重组pColdⅡ-gB蛋白浓度为0.701mg/mL，纯化的重组pET-28a-gD蛋白浓度

5、为0.518mg/mL。利用纯化的重组蛋白pColdⅡ-gB和重组蛋白pET-28a-gD作为包被抗原建立了三种检测IBRV抗体的ELISA检测方法，分别命名为gB-ELISA、gD-ELISA和gB+gD-ELISA。通过对ELISA方法各条件的优化试验，确定了gB-ELISA、gD-ELISA最佳抗原包被浓度分别为2.804μg/mL，4.144μg/mL。gB-ELISA、gD-ELISA和gB+gD-ELISA血清稀释浓度分别为1:80、1:40和1:80；最佳血清反应时间为37℃1h；最佳封闭液均为1%BSA；最佳酶标二抗浓度为1:12000、1:15000和1:12000；最佳酶标

6、二抗反应时间为37℃1h；最佳底物反应时间为10min；阴阳性判定临界值为0.311、0.346和0.292。特异性和重复性试验表明，三种ELISA方法特异性和重复性均较好。应用三种方法对341份临床样品检测，与瑞典SVANOVAIBR-AbELISA检测试剂盒相比，符合率分别为93.427%、92.965%和95.673%。本研究分析了IBRVSH7株gB、gD基因的同源性，并建立了三种IBRV抗体的间接ELISA检测方法，三种方法与国外商品化检测试剂盒相比，符合率较高，其中gB+gD-ELISA符合率最高，为进一步研制检测试剂盒提供了新的思路I和技术支持。关键词：牛传染性鼻气管炎；gB；g

7、D；间接ELISAIIAbstractIBR（InfectiousBovineRhinotracheitis）isancontagiousdiseaseofcowcausedbyIBRV(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus),whichbelongstoAlphaherpesvirinae,Herpesviridae.ItislistasBclassdisea