虎源传染性鼻气管炎病毒gD基因重组真核表达载体的构建.pdf

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1、动物医学进展。2014，35(9)：70—73ProgressinVeterinaryMedicine虎源传染性鼻气管炎病毒gD基因重组真核表达载体的构建张晓明，胡俊，彭仕明，陈武。(1．华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2．广州动物园，广东广州510070)摘要：根据从虎气管组织扩增获得的猫传染性鼻气管炎病毒相关核酸序列，设计扩增编码虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因片段的引物，通过PCR扩增出gD基因片段，并成功插入到pMD18一TSim—pie载体中，筛选获得重组质粒，命名为18T-gD。重组质粒通过dⅢ和Xho工酶

2、切后，插入pcDNA3．1(+)真核表达载体构建出gD基因的重组真核表达质粒pcDNA-gD。用脂质体将重组真核表达质粒pcD—NA—gD转染293T细胞，通过RT-PCR和Westernblot检测，结果显示gD基因在真核细胞中得到正确转录和表达，所表达蛋白分子质量约为42．29ku，为虎源猫传染性鼻气管炎基因疫苗的研究奠定了基础。关键词：虎源传染性鼻气管炎病毒；gD基因；聚合酶链反应；真核表达中圈分类号：$852．659．1；Q784文献标识码：A文章编号：1007—5038(2014)09—0070—04疱疹病毒工型属于疱疹病毒

3、科中的a疱疹病1材料与方法毒，可引起猫科动物的急性、高度接触性的上呼吸道1．1材料感染，发病率可高达100oA[1]。虽然成年猫科动物1．1．1细胞、菌株和载体293T细胞、pcDNA3．1感染后大多痊愈，病死率很低，但幼仔感染后症状严(+)表达载体和DH5a大肠埃希菌均由华南农业大重，病死率可达5O，甚至终生带毒排毒，并可垂直学兽医学院保存。传播，危害很大_2]。该病毒于1958年由CrandeRA1．1．2试剂限制性内切酶tBndⅢ和Xho工、和Maurer首次从美国患呼吸道疾病的仔猫体中分DreamTaqTMPCRMasterM

4、ix、转染试剂TurboFect离鉴定口]，随后在欧亚等一些国家也相继报道检测TransfectionReagent，Fermentas公司产品；病毒到病毒。2012年4月和6月江苏省苏州动物园和广DNA提取试剂盒(viralDNAextractionkit)DNA东某养殖场以流鼻涕、咳嗽和支气管充血和出血为胶回收试剂盒(GelExtractionKit)和质粒小提试剂主要症状的东北虎和华南虎出现流鼻涕、咳嗽和支盒(Endo—FreePlasmidMiniKitII)，Omega公司产气管充血和出血等临床症状，肖建雄等[4研究证明品；

5、RNA抽提试剂(Trizo1)，Invitrogen公司产品；了患虎感染的病毒是传染性鼻气管炎病毒，该病毒pMD18一TSimple克隆载体、T4DNA连接酶、cD—与猫疱疹病毒I型基本一致。NA反转录试剂盒(PrimeScript1II1stStrandcD—预防虎源传染性鼻气管炎主要以注射疫苗免疫NASynthesisKit)，TaKaRa公司产品；抗his标签为主，但注射猫传染性鼻气管炎疫苗的保护作用甚微，国外动物园也报导类似情况l_5]。因此，应研制针一抗，Bioworld公司产品。对虎源传染性鼻气管炎的疫苗来预防虎源传染性鼻

6、1．2方法气管炎，其中研制DNA基因工程疫苗是现时比较1．2．1引物合成根据GenBank已公布的猫传染快速与良好的方法。猫疱疹病毒I型基因组编码多性鼻气管炎病毒基因组序列(序列号FJ478159)设种蛋白质，其中gD糖蛋白具有高度的保守性和抗计了扩增gD基因的一对引物，为方便检测，在上游原性，gD蛋白能与细胞表面分子发生特异性结合，引物引入his标签，同时在上、下游引物分别引入了诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，是病毒感染特HindⅢ和Xho工酶切位点(下划线部分)。引物序异性宿主的主要作用蛋白_6]。本研究对疱疹病毒I歹0如下：上游

7、：5一CCCAAGCTTCACCATCAT—型的gD基因进行了扩增、克隆及构建真核表达载CACCATCATATGAGAC一3；下游：5'-CCGCTCG体，为进一步研究虎疱疹病毒I型的基因工程DNAAGTTATAGATGGTGAG一3；引物由Invitrogen疫苗奠定了基础。公司合成。收稿日期：2013—12—31作者简介：张晓明(1987-)，男，广东广州人，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究。*通讯作者张晓明等：虎源传染性鼻气管炎病毒gD基因重组真核表达载体的构建73降解；③外源基因在动物细胞内能够高效表达，但l46一l51．[

8、5]WitteCarmelL，NadineL，RideoutBruceA，eta1．Develop—不复制，其表达抗原蛋白的能力越强，诱导宿主产生mentofacasedefinitionforclinicalfelin