表达传染性喉气管炎病毒gb、gd基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗毒株构建及其免疫效力试验

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2、。為雜．變、－孙燕－－為－，－身．Ｔ響皆汽－－－乐Ｖ，八．．吟’指导勃师姓名；吴艳涛教授，２２５００９．，扬州大学，狂苏扬州、申请学位级别：硕击学科专业名称：预防兽医学日期：２０１５年６月论文答辩日期＝２０１５年６月３曰—论专標专２０１５年６３０曰学位授予单位：扬州大学学位授予日期；月亚斌研究员－答辩委员会主席＝戴．二＂＾，—边—秦珠、、－＇＇，？＾＂．－仁＜、．；与挺争不ｔ－；■Ｈ产，．ｒ２〇ｉ５年６月才葦Ｋ３ｆｃ＾二？，可二公？：．：．；Ｉ试＾響蘇鐵％：剪辟＿’

3、’－每公乂护六讀篆旅．１、若点技／孙燕：表达传染性喉气管炎病毒ｇＢ、ｇＤ基因的重组火鸡疮疹病毒疫苗毒株构建１表达传染性喉气管炎病毒处、ｇＤ基因的重组火鸡疮疹病毒疫苗毒株构建及其免疫效力试验摘要传染性喉气管炎（ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓｌａｒｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓＩＬＴ）是由传染性喉气管炎病毒ｙ，一（虹ｆｅｃｔｉｏｕｓｌａｒｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓｖｉｍｓＩＬＴＶ）ｙｇ，所引起的种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病，给世界范围内的养鸡业造成了巨大经济损失。目前，国内外预防本病主要依靠弱毒疫苗，但弱毒疫苗的毒力偏强，接种后

4、往往出现不良反应，由；另外于正ＴＶ可潜伏感染，弱毒疫苗在鸡群传播过程中会发生毒力返强。对国内部分地区ＩＬＴ的流行病学研巧发现，ＩＬＴ的暴发可能与弱毒疫苗有关。因此，研制安全有效的基因工程疫苗已成为人们的共识。－至含有ＩＬＴＶＡｎｈｕｉ２０１１株为模板扩增、Ｄ基因本研究Ｗ班ｇ，然后分别将其克隆ＨＶＴ）ＦＣ－－火鸡疮疹病毒１２６ＵＳ２ＵＤｏｗｎ）中，（疫苗毒株基因组序列的转移载体（ｐｐ－－Ｕ－－Ｄｏｗｎ构建转移质粒ｐ班、ｐＵｐｇＤＤｏｗｎ。随后将含有ＬＴＲ启动子和ＥＧＦＰ报舍基ｐ－Ｂ－因的表达盒分别克隆至上述转移质粒中，构建ＨＶ

5、Ｔ转移载体ｐＨＶＴｇ、ｐＨＶＴｇＤ。采用磯酸巧转染法将转移载体与ＨＶＴ基因组共转染ＣＥＦ次代细胞，获得带有绿色英光标记的重组病毒。提取重组病毒基因组，用Ｃｒｅ重组酶敲除ＥＧＦＰ报告基因，通过再次转－－染Ｃ卧次代细胞，获得仅带有ＬＴＲ启动子和目的基因的重组病毒ｒＨＶＴｇＢ、ｒＨＶＴｇＤ。－通过ＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ试验对重组病毒进行鉴定，结果表明目的基因ｇＢ、ｇＤ成功插入ＨＶＴ基因组中，并能正确表达ｇＢ、ｇＤ蛋白。？重组病毒对比Ｔ的免疫保护试验：９０只１日龄ＳＨ５组将鸡随机分为，第１、２沮为重组病毒免疫组，第３组为攻毒对照组，

6、第４组为弱毒活疫苗对照组，第５组为空白５对照组。弱毒疫苗免疫３周后，除空白对照组，各试验组均气管内接种１０ＥＩＤ５０ＩＬＴＶ强毒，继续观察１０天。统计分析各组临床症状、攻毒前后鸡体増重、发病率死亡率、抗体消长及病理组织学变化。结果显示：攻毒后第二天即有鸡发病，临床症状高峰期出－现于攻毒后第四天。重姐病毒ｒＨＶＴｇＢ的发病率为２０％，死亡率为５％，免疫保护高于＜０－弱毒苗组．０５）重组病毒ｒＨＶＴＤ的发病率为３０％，死亡率为１５％，，差异显著（ｐ；ｇ＞免疫保护高于弱毒苗组．。Ｆ鸡接种重组，但差异不湿著（Ｐ＞〇〇５）结果表明，１日龄Ｓ

7、Ｉｒ－ｒ－病毒后能建立起针对正Ｔ强毒株的有效保护，且ＨＶＴｇＢ明显比ＨＶＴｇＤ组免疫保护２扬州大学硕±学位论文效果好。：将６０只１日龄Ｓ巧鸡随机分为４组重组病毒对ＭＤ的免疫保护试验，第１、２３－组分别为重组病毒免疫组，第组为ＦＣ１％疫苗组，第４组为攻毒对照姐。免疫１周后，各试验组均腹腔接种５０００ＰＦＵＭＤＶ超强毒株ＲＢ１Ｂ。攻毒后每天观察鸡群至９０日龄－。结果显示毒株ＦＣ１２６，重组病毒与亲本均可对ＭＤ超强毒株的攻击产生有效免疫保护，说明外源基因的插入并不影响亲本毒株的免疫保护效力。关键词：传染性喉气管炎病毒；重组病

8、毒；火鸡疮疹病毒；免疫保护效力Ｂ３孙燕＝表达