牛传染性鼻气管炎病毒gd基因的表达及elisa诊断方法的建立

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1、摘要牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV）可引起牛发生急性、热性、接触性传染病--牛传染性鼻气管炎（Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR）。主要表现为呼吸道和生殖道感染。IBRV主要的基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因，其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面，能诱导机体产生保护性抗体的抗原，因此gD可作为鉴别诊断IBR的首选特异性抗原。本试验以IBRV的gD基因为研究对象，通过原核表达蛋白后，用其建立检测IBRV抗体的间接E

2、LISA诊断方法，并进行初步应用，目的是期望在临床实践中能够快速检测和诊断牛传染性鼻气管炎病，为今后该病的检验检疫和净化提供技术支持。本研究主要进行了如下两个方面的研究工作：一、IBRVgD基因的原核表达根据Genbank上发表的gD基因序列，设计合成3对特异性引物，利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD。将其转入BL21（DE3）表达菌中，利用IPTG诱导表达。经酶切鉴定及基因测序均证明原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明，gD融合蛋白主要以包涵体形式

3、在大肠埃希菌中高效表达，成功获得了大小约为48ku的融合蛋白，与预期的蛋白分子量一致。纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg/mL，免疫印迹的结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应，说明其免疫原性良好。二、IBRV抗体间接ELISA方法建立与初步应用以纯化的IBRVgD蛋白为包被抗原，建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。通过对各种反应条件的优化，确定最佳包被抗原浓度为6.4μg/mL，包被时间为4℃过夜，血清稀释度为1:50，血清反应条件为37℃1h，封闭液为5%脱脂乳，HRP-兔抗牛IgG的

4、最佳工作浓度为1:10000，最佳显色时间为37℃15min，经统计学分析后确定的阴阳性临界值为0.219。结果显示，利用本研究所建立的ELISA方法不但特异性强，而且重复性稳定。应用本试验所建立检测方法和IDEXX试剂盒，分别对442份来自黑龙江省部分地区未经免疫的牛血清样本进行检测，结果显示在442份血清样本中102份样本IBR抗体呈阳性，血清阳性率为23.1%，与IDEXX试剂盒达到90.2%的符合率。临床检测结果显示，所建立的检测方法具有特异、敏感和稳定性好的优点，应用前景广阔。关键词：IBRV；gD；原核表达；间接E

5、LISAIAbstractInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV)ismainpathogenofInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBR).IBRVoftencausedsevererespiratoryandgenitaltractinfectionofbovine.GlycoproteingDproteinwaslocatedonthesurfaceofvirusenvelope,whichcanstimulateorganismtoge

6、nerateneutralizingantibody,soitcouldbeusedtodiagnosticreagentforIBRV.Inthepresentstudy,prokaryoticexpressionofIBRVgDgenetoestablishanindirectELISAmethodtodetectantibodiesagainstIBRV,expectingthatitcanfastdiagnoseIBR.Thisstudymainlycontainstworesearches:Apairofprimer

7、swasdesignedaccordingtotheIBRVgDsequencesinGenBanktoamplifythecompleteopenreadingframe.PCRproductofgD,containingthreeepitope:gD-A、gD-B、gD-C,wastheninsertedintointotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a-gDrespectively,thentransformtherecombinantplasmidintocompetentcel

8、lsofBL21(DE3).AfterinducedbyIPTG,bothofthemweresuccessfullyexpressedandidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandgenesequencing.SDS-PAGEdem