t7噬菌体衣壳蛋白p11的原核表达、 纯化及其单

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1、T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单【摘要】目的:表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法:克隆并表达T7噬菌体P11蛋白,其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:成功表达了P11蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为27000。获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株（2G11）,其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105。SF）重悬细菌沉淀,经超声破碎细菌后,以12000r/mi

2、n离心10min。取上清,采用DuoFlomol/LPB、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰,120g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。　　1.2.3动物免疫　　用400μL纯化的p11蛋白（1.0g/L）稀释于6000μLPBS（0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl）并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化,多点皮下注射免疫BALB/c小鼠（50μg/只）。1个月后,经腹腔注射加强免疫,用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原,注射剂量同前,后每隔2周分别进行第3次和第4次加强免疫。　　1.2.4细胞融合与抗体制备　　E

3、LISA法检测抗血清的效价,取效价最高的老鼠,脾内注射10μg抗原加强免疫,4d后,取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合［7］。用间接ELISA法［8］筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有限稀释法克隆化后,选择1株mAb持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前1周,小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞,用不完全培养液悬浮并混匀,将细胞数调至(1～2)×109/L,每只小鼠腹腔注射0.5mL,1周后小鼠腹部明显肿胀,消毒下腹部皮肤后,抽取腹水,获得腹水经3000r/min离心15min,收集上清。硫酸铵法初步纯化腹水,以用于后

4、续检测。　　1.2.5mAb的效价和亚类鉴定　　①效价测定:采用间接ELISA法。用PBS稀释10μLP11蛋白（1mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗为稀释的腹水样本,二抗为1∶1000的HRP羊抗鼠IgG,经ABTS底物显色后,于波长405nm测定A值。②Ig亚类（型）的鉴定：间接ELISA法（参照试剂盒的说明书进行）。③特异性鉴定:Ab反应过夜,再与HRP标记的羊抗鼠IgG37℃孵育2h,经显色液显色后压片观察结果。　　2结果　　2.1重组质粒的鉴定　　重组表达质粒pET28a(+)/G11经NdeI和BamHI酶切后分别出现5927、598bp的电泳条带（图

5、1）,与预期大小相符,测序结果与文献发表的序列一致,未发现突变碱基存在,说明重组原核表达载体构建正确。　　2.2G11基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化　　将重组表达质粒pET28a(+)/G11转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达表达4、6和8h。表达产物经SDSPAGE后,在Mr约27000处可见1条明显的蛋白带（图2）。该蛋白的氨基端带有Histag,大量诱导表达Ni2+柱亲和层析纯化后,用BCA法定量,可溶性表达蛋白含量为1.0mg/L。　　2.3抗P11蛋白mAb的制备和初步鉴定　　血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进行

6、融合,结果筛选到1株阳性克隆,命名为2G11。经ELISA检测,1株mAb腹水的效价为1∶8.1×105。其Ig亚类为IgG2b、r为27000处T7噬菌体蛋白和重组P11蛋白有一明显条带,而未经诱导菌体蛋白、P10his蛋白和T4噬菌体蛋白则无此反应（图3）。　　3讨论本实验中我们构建了原核表达载体pET28a(+)/G11,鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达羧基端含6×His标签的可溶性融合蛋白。利用6×His标签和镍离子特异性螯合的特性纯化,得到高纯度的目的蛋白。以纯化P11蛋白为抗原,通过杂交瘤技术成功获得了抗P11的mAb。　　T7噬菌体

7、具有的强大的外源蛋白或多肽展示能力,已经被广泛应用于cDNA文库展示,如最近就有人利用T7噬菌体展示前列腺癌组织的cDNA文库［9］,然后利用文库技术与噬菌体芯片技术结合找到了一些前列腺癌的自身抗原及自身抗体。在实际工作中,我们发现制备T7噬菌体芯片时,需要对展示不同多肽的噬菌体进行定量检测（未发表资料）,如果能够首先在芯片上点上抗T7噬菌体的抗体,然后再点上T7噬菌体,那将有望使芯片上的T7噬菌体较均一;而且由于P11位于T7噬菌体的尾部（图4）,这样的点样方式,也将使融合于P10的蛋白或多肽更加有效的展示,进而使筛选更加有效。此外,关于T7噬菌体尾蛋白P11参

8、与包装的具