t7噬菌体衣壳蛋白p11的原核表达、 纯化及其单克隆抗体的制备

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1、T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备【摘要】目的:表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法:克隆并表达T7噬菌体P11蛋白,其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果:成功表达了P11蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为27000。获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株（2G11）,其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测,对应腹水mAb的效价为1∶8.1×105

2、。Westernblot结果显示抗P11mAb具有良好的特异性。结论:成功地制备了P11蛋白及其mAb。【关键词】T7噬菌体P11蛋白核表达单克隆抗体T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体［1］,基因组为线状双链DNA,长39936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白PlOA、次要头蛋白P1OB、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17［2,3］。T7噬菌体作为一种常见的展示系统［4-6］,因其载体容量大,插入片段稳定,洗涤条件灵活,生长周期短而被广泛使用。为进一步研究T7噬菌体尾蛋白P11蛋白结构和功能,并为建

3、立T7噬菌体快速准确的检测方法奠定基础,我们进行了原核表达、纯化P11蛋白并制备出具有良好特异性的mAb。9　　1材料和方法　　1.1材料　　质粒pET28a(+)、T7select103bcontrol,大肠杆菌Top10株,大肠杆菌BL21（DE3）以及Sp2/0细胞均由本室保存。限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ均购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。NiNTAHisBindresin购自Amersham公司。　　HRP羊抗鼠IgG和Ig亚类（型）鉴定试剂盒Sigma公司产品。BALB/

4、c小鼠由本研究所实验动物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1重组原核表达载体的构建　　以T7select103bcontrol质粒为模板,加入针对G11基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物为:5′ggaattccatatgatgcgctcatacgatatgaac3′（划线处为NdeI酶切位点）下游引物为:5′cgggatccttagcgagtcagtagaccag3′（划线处为BamHI酶切位点）。扩增反应的条件为:94℃变性5min,然后进行30个循环:94℃30s,58℃45s,72℃60s,最后72

5、℃延伸89min。用胶回收试剂盒纯化PCR产物,用NdeI和BamHI双酶切PCR产物和pET28a(+),T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌Top10株,抽取质粒,NdeI和BamHI双酶切鉴定并测序确认正确,成功构建重组表达载体pET28a(+)/G11。　　1.2.2重组P11蛋白的表达及纯化　　将pET28a(+)/G11转化大肠杆菌BL21(DE3)。用异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）分别诱导表达4、6、8h,通过SDSPAGE分析比较诱导前后结果。挑单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB培

6、养基中,37℃震荡培养过夜,按1∶100转接到200mL培养基中,37℃培养至A600为0.6时,加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L,30℃诱导表达4h。收集菌液,以8000r/min离心10min收集菌体,用缓冲液A（pH7.4、20mmol/LPB、0.5mol/LNaCl、1mmol/LPMSF）重悬细菌沉淀,经超声破碎细菌后,以12000r/min离心10min。取上清,采用DuoFlow系统（BioRad）NiNTA亲和柱层析,缓冲液B（pH7.4、20mmol/LPB、0.5mol/LNaCl、

7、0.5mol/Limidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰,120g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。　　1.2.3动物免疫9　　用400μL纯化的p11蛋白（1.0g/L）稀释于6000μLPBS（0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl）并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化,多点皮下注射免疫BALB/c小鼠（50μg/只）。1个月后,经腹腔注射加强免疫,用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原,注射剂量同前,后每隔2周分别进行第3次和第4次加强免疫。　　1.2.4细胞融合与抗体制备　　ELISA法检测抗血清的效价,取效价最高

8、的老鼠,脾内注射10μg抗原加强免疫,4d后,取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合［7］。用间接ELISA法［8］筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有限稀释法克隆化后,选择1株mAb持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前1周,小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞,用不完全培养液悬浮并混匀,