乙酰肝素酶的原核表达及其单克隆抗体的制备

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分类号：__________密级:__________UDC:__________乙酰肝素酶的原核表达及其单克隆抗体的制备ExpressionofHumanRecombinantHeparanaseinE.coliandproductionofmonoclonalantibodiesagainsthumanheparanase姓名：杜欣娥学号：2110940048院系：药科学院专业：药剂学研究方向：生物技术与制药工程导师姓名：田素娟教授论文提交日期：2012-4-1论文答辩日期：2012-5-21学位授予单位：广东药学院二〇一二年四月 广东药学院硕士研究生学位论文广东药学院学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做出贡献的其它个人和集体，均已在文中明确说明和致谢。本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。学位论文作者签名：＿＿＿＿＿日期：年月日学位论文使用授权的声明本人完全了解广东药学院有关保留和使用学位论文的规定，学校有权保留和向有关部门或机构送交本论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编本学位论文。保密论文在解密后适用本声明。论文作者签名：＿＿＿＿＿论文导师签名：＿＿＿＿＿日期：年月日 广东药学院硕士研究生学位论文目录目录.................................................................................................................................I英文缩略词表..................................................................................................................III中文摘要...........................................................................................................................VABSTRACT.....................................................................................................................VI序言.................................................................................................................................11HPSE在肿瘤转移中的作用........................................................................................12人HPSE基因以及人HPSE蛋白结构........................................................................23HPSE相关抑制剂.......................................................................................................34HPSE真核以及原核表达...........................................................................................35抗HPSE单克隆抗体的应用以及研究现状...............................................................4第一部分HPSE原核表达系统的构建以及表达条件优化..............................................61实验材料.....................................................................................................................61.1质粒和菌株..........................................................................................................61.2主要试剂..............................................................................................................61.3溶液配制..............................................................................................................61.4主要设备..............................................................................................................82实验方法.....................................................................................................................92.1目的DNA的扩增................................................................................................92.2原核表达载体的准备.........................................................................................112.3.pET-28a(+)-HPSE的克隆和鉴定.......................................................................122.4.重组人HPSE菌株的诱导表达及条件优化......................................................152.5.重组人HPSE蛋白的表达形式的确定.............................................................162.6.重组人HPSE蛋白的纯化..................................................................................173结果..........................................................................................................................183.1人HPSE以及质粒相关结果..............................................................................183.2人HPSE蛋白表达结果.....................................................................................233.3重组人HPSE纯化相关结果............................................................................274讨论..........................................................................................................................29第二部分人HPSE单克隆抗体的制备..........................................................................311实验材料与仪器.......................................................................................................311.1实验动物............................................................................................................311.2实验用品............................................................................................................311.3实验仪器............................................................................................................321.4溶液配制............................................................................................................322实验方法...................................................................................................................342.1BALB/c小鼠的免疫...........................................................................................34I 广东药学院硕士研究生学位论文2.2细胞融合相关物品以及细胞的准备..................................................................362.3细胞融合............................................................................................................372.4杂交瘤的选择与克隆化.....................................................................................382.5小鼠腹水单克隆抗体的制备.............................................................................392.6单克隆抗体小鼠抗体亚类鉴定(捕获ELISA法)................................................402.7HPSE单克隆抗体的纯化...................................................................................402.8HPSE单克隆抗体亲和常数的测定...................................................................41[42]2.9HPSE单克隆抗体特异性的鉴定...................................................................413结果..........................................................................................................................423.1BCA蛋白浓度测定试剂盒测定抗原蛋白含量..................................................423.2抗原抗体工作浓度的确定.................................................................................433.3免疫小鼠血清效价测定.....................................................................................443.4细胞融合后生长状况.........................................................................................463.5杂交瘤数据统计.................................................................................................463.6阳性筛选结果....................................................................................................473.7腹水效价测定....................................................................................................483.8单克隆抗体小鼠抗体亚类鉴定..........................................................................483.9纯化抗体浓度....................................................................................................483.10抗体亲和常数的测定.......................................................................................493.11WesternBlot检测抗体特异性结果..................................................................504讨论..........................................................................................................................51结论.................................................................................................................................53参考文献：......................................................................................................................54攻读学位期间发表的论文...............................................................................................58致谢.................................................................................................................................59II 广东药学院硕士研究生学位论文英文缩略词表AlaAlanine丙氨酸AmpAmpicillin氨苄青霉素APAmmoniumpersulfate过硫酸铵AspAsparagine天冬酰胺BCABicinchoninicacid2,2-联喹啉-4,4-二甲酸bFGFBasefibroblastgrowthfactor碱性成纤维因子BMBasementMembrane基底膜BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白CBSCarbonatebuffersaline碳酸盐缓冲液DABDiaminobenzidine二甲基联苯胺DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜dNTPsDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸EBEthidiumBromide溴化乙锭ECMExtracellularMatrix细胞外基质EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸ELISAEnzyme-linkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附实验ERKExtracellularregulatedproteinkinases细胞外调节蛋白激酶FBSFetalbovineserum胎牛血清FGFFibroblastgrowthfactor成纤维因子GlnGlutamine谷氨酰胺GluGlutamicacid谷氨酸HAHypoxanthinAminopterin次黄嘌呤、氨甲喋呤HATHypoxanthinAminopterinThymidine次黄嘌呤、氨甲喋呤、胸腺嘧啶核苷HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶HPSEHeparanase乙酰肝素酶HPSEHeparanase人乙酰肝素酶基因HSPGHeparanSulfateProteoglycan乙酰肝素蛋白多糖III 广东药学院硕士研究生学位论文HisHistidine组氨酸HSHeparinSulfate硫酸肝素IgImmunoglobulin免疫球蛋白IleIsoleucine亮氨酸IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷kDaKiloDalton千道尔顿LBLuriaBertanimediumLB培养基LysLysine赖氨酸MMPsMatrixmetalloproteinases基质金属蛋白酶MetMethionine甲硫氨酸mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸ODOpticaldensity光密度PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇ProProline脯氨酸PVDFPolyvinylidenedifluoride聚偏二氟乙烯SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠SerSerine丝氨酸StpStreptomycinSulfate硫酸链霉素TEMEDN,N,N',N'-TetramethylethylenediamineN,N,N',N'-四甲基乙二胺TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子IV 广东药学院硕士研究生学位论文乙酰肝素酶的原核表达及其单克隆抗体的制备中文摘要目的：虽然已经明确了HPSE在肿瘤转移中的相关作用，但还有很多方面有待研究，为了研究HPSE在肿瘤发生、肿瘤浸润、转移及血管生成中所起的作用，获得大量的HPSE以及其抗体，就显得很有必要。本研究利用原核表达系统获得相关HPSE抗原，成功得到以包涵体形式表达的人全长HPSE蛋白，并运用杂交瘤技术获得抗HPSE的单克隆抗体。方法：依据NCBI上公布的人HPSEcDNA序列，设计可以克隆HPSE全长片段的引物，选择NcoⅠ和XhoⅠ作为酶切位点，将HPSE全长基因片段连接到pET28a(+)质粒上，在大肠杆菌中表达HPSE蛋白；探索不同诱导时间、不同浓度的诱导剂IPTG以及所用的培养基对重组人HPSE蛋白表达的影响；运用HisTrapTMcrude柱得到纯度较高的重组人HPSE蛋白。本室自制的重组人HPSE50kDa蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术将SP2/0与免疫B淋巴细胞融合，间接ELISA检测抗体分泌情况，ELISA所用的抗原为158172重组人HPSE全长蛋白、重组人HPSE50kDa蛋白以及人HPSE多肽Lys-Cys，该多肽包含底物肝素与HPSE结合的特定序列，即HPSE的活性位点。阳性克隆进行多次筛选以及亚克隆，得到抗HPSE的单克隆抗体。Westernblot检测所制备的抗原与抗体结合的特异性。结果：成功在大肠杆菌中表达出重组人HPSE全长蛋白，并得到其最佳表达条件为：IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间为5h，在2×YT培养基中诱导时目的蛋白表达量最高。成功的筛选出两株特异性较好抗HPSE的单克隆抗体，4D12、3F5效价均大于59-18-11:1.28×10，其亲和力常数分别为2.71×10M、6.67×10M，4D12与50kDaHPSE、人全长HPSE反应，3F5与50kDaHPSE、人全长HPSE以及HPSE50kDaN端的158172Lys-Cys多肽反应。结论：成功构建了人HPSE原核表达系统，并筛选出两株特异性好抗HPSE的单克隆抗体。关键词：乙酰肝素酶；原核表达；单克隆抗体V 广东药学院硕士研究生学位论文ExpressionofHumanRecombinantHeparanaseinE.coliandproductionofmonoclonalantibodiesagainsthumanheparanaseMajor:PharmaceuticsNameofPostgraduate:DuXin’eSupervisor:ProfessorTianSujuanAbstractObjective:Recentstudiesshowedthatheparanase(HPSE)playsanimportantroleintumormetastasis,butmanydetailsremainunkown.InordertostudytheroleofHPSEintumorigenesis,invasion,metastasis,andangiogenesis,itisnecessarytoproductHPSEanditsantibody.Methods:UsingthetargetnucloetidesequencereleasedbyGenBank,twoprimersweredesignedtoclonethefull-lengthfragmentcDNAofHPSE.Thefull-lengthhumanHPSEgenewasclonedintotheexpressionvector,pET28a(+),therecombinantplasmidwastransformedintoE.coli.Aftertransformation,E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)wasinducedtoexpresshumanHPSEproteinbyIPTG.Differentinductiontime,theproperconcentrationofIPTGanddifferentmediawhichmayinfluencetheexpressionlevelofhumanHPSEproteinwerediscussed.HisTrapTMcrudecolumnwasusedtopurifyrecombinantHPSEprotein.HPSEprotein(50kDa)wasusedtoimmuneBALB/c.Afteraboutonemonth,SP2/0andBlymphocytewereinfusedbyhybridomatechnique.IndirectELISAwasusedtodetectthesecretionofantibody,theantigensforELISAwerefull-lengthhumanHPSE158172protein,HPSEproteinandpolypeptideLys-CysofHPSE(50kDa).ThepolypeptidehastheactivitysiteofHPSEthatbindstotheheparin.HPSEpositivecloneswererepeatedlyscreenedandsubcloned.ThespecificityofmonoclonalantibodiesagainsthumanHPSEwasdetectedbyWesternblot.VI 广东药学院硕士研究生学位论文Results:Full-lengthrecombinanthumanHPSEproteinwasexpressedinE.coli.WhentherecombinantE.coliwasincubatedin2×YTmedia,theconcentrationofIPTGwas1mmol/L,after5hinducing,thehighestexpressionlevelofHPSEwasobtained.TwocelllinesthatsecretmonoclonalantibodiesagainsthumanHPSEwerecloned.Thetitersof59-18McAb4D12、3F5werehigherthan1.28×10,theiraffinitieswere2.71×10M、6.67×10-1M，respectively.4D12hadreactivitywithfull-lengthhumanHPSEprotein，HPSEprotein(50kDa).3F5hadreactivitywithfull-lengthhumanHPSEprotein，HPSEprotein(50kDa)158172andapeptidewith15aminoacidresiduesLys-CysfromN-terminusofHPSE(50kDa).Conculusion:TheprokaryoticexpressionsystemforhumanHPSEwasconstructedsuccessfully.TwocelllinesthatsecretmonoclonalantibodiesagainsthumanHPSEwereobtained.Keywords:heparanase;E.coli;monoclonalantibodyVII 广东药学院硕士研究生学位论文序言1HPSE在肿瘤转移中的作用近年来，对肿瘤发生、发展、诊断和治疗的研究越来越多，如新的生物标志物的[1][2-4]发现、新的抑癌或者促进癌症发生的基因的发现、抗肿瘤药物的单化疗或两种甚至三种药物的综合化疗对癌症治愈的研究，而在这些研究中对肿瘤浸润和迁移的研究[5-7]更是如火如荼。肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，需要突破细胞外基质(Extra-cellularMatrix，ECM)和基底膜（BasementMembrane，BM）组成的屏障。ECM和BM是限制肿瘤细胞侵袭和转移的主要组织学屏障，在肿瘤从原发部位转移到继发部[8]位，并在继发部位形成继发瘤（转移灶）的过程中，ECM和BM的降解是关键环节。ECM和BM主要有两种成分构成，即结构蛋白和糖胺聚糖，结构蛋白包括胶原、层粘素和纤维结合素等，糖胺聚糖的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparansulfate[9]proteo-glycans，HSPGs）。乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是目前发现哺乳动物[10-12]中唯一可以切割HSPGs侧链硫酸乙酰肝素(heparanSulfate，HS)的β-内切糖苷酶，基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是水解ECM和BM中蛋白组分[13,14]的关键酶类。HSPGsHS侧链的切割不仅改变ECM的完整性，还释放与HS结合的生物介质，如生长因子、趋化因子、细胞因子以及与ECM和细胞表面相关的酶类。HS与血管生长因子有很强的亲和力，能稳定bFGF和其他生长因子，FGF类因子与HS结合存储在ECM中,也能够转运到BM或细胞表面，增强脂质代谢、促进血管的胆固醇化。bFGF和VEGF，通常以和HS形成聚合物的形式储存在肿瘤的微环境中，当HS被降解时，[15-17]这些蛋白释放出来诱导毛细血管的生成。如此，HPSE促进肿瘤发展的机制可以总结为：HPSE通过降解BM和ECM中的HSPGs，释放活性物质，产生链式反应，加快血管生成，促进肿瘤生长和转移。[18]研究发现，人淋巴细胞瘤、口腔癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等转移浸润能力强的癌组织或细胞系中HPSE表达水平高，而低转移能力或无转移能力的癌组织和肿瘤细胞没有或仅有少量表达；在对癌症病人的预后研究中发现，HPSE表达水平高的预后差。由于HPSE对HSPGs侧链的切割会加速ECM和BM的降解，进而加速肿瘤的转1 广东药学院硕士研究生学位论文移与侵袭，因此，尝试制备抑制HPSE功能的药物，延长癌症病人的生存期，提高生活质量。2人HPSE基因以及人HPSE蛋白结构人类HPSE有两种亚型，即HPSE1和HPSE2，目前研究最多的是HPSE1。HPSE基因是一个高度保守的单拷贝基因，位于4号染色体q21.3上，长约40kb，13个内含子，含有14个外显子。通过选择性剪切,可以被转录为含有相同开放阅读框（长约1629bp）的两种mRNA（分别为4.4与2.0kb），开放阅读框可以编码一种相对分子[19-20]质量约为61.2kDa，由543个氨基酸残基组成的多肽链。完整的HPSEcDNA长约1.7kb，由该序列反转录得到的多肽链不具备酶活性，但是在专一性蛋白水解酶的作用下，可以水解成两部分，这两部分具有酶活性。有研[12]135究表明，HPSE蛋白在翻译后加工过程中，N-端信号肽（Met-Ala）被切除，成为15854336酶原前体，HPSE酶原前体包含有3部分，50kDa（Lys–Ile）、8kDa（Gln–109110157Glu）以及6kDa（Ser–Gln），HPSE酶原前体中这3个部分是相连的，此时HPSE没有活性。在专一性蛋白水解酶的作用下，HPSE3个部分分开，50kDa和8kDa共价结合形成二聚体后，才具有成熟酶的活性。HPSE前体的氨基酸序列中含有两个疏水域（一个是信号肽序列，位于N-端第7个~30个氨基酸处；另一个是跨膜序列，位于N-端第515个~534个氨基酸处)和一个亲水域(位于N-端第110~170个氨基酸处)。疏水域使酶结合在膜上，从而可以分泌到细胞外而行使功能，亲水域易于暴露，被专[19-20][21]一性蛋白酶水解成为具有高度生物活性的成熟酶。已有研究表明HPSE有6个N-糖基化位点，其中有5个集中在HPSE50kDa的前80个氨基酸序列中，糖基化不271278影响HPSE的酶活性但是会调控HPSE蛋白的分泌。将Pro-Met序列删除会导致158162271278酶原前体聚集，抑制活性HPSE的分泌。Lys-Asp(50kDaN-端)、Pro-Met较158162为保守，为硫酸肝素的结合序列。包含有Lys-Asp的多肽可以和肝素以及HS紧密结合，与HPSE竞争底物HS，从而抑制HPSE的活性。HPSE有两个保守酸性残225343基，即Glu电子供体和Glu质子供体，这两个部位对HPSE的活性起重要作用，[22]158162225343是HPSE的活性中心。Lys-Asp接近HPSE的活性中心Glu、Glu，为抑制HPSE的有效靶标序列。2 广东药学院硕士研究生学位论文3HPSE相关抑制剂已经明确HPSE的过表达会促进肿瘤的转移，故可以从抑制HPSE的表达或酶活[22-23]性来抑制肿瘤的转移。目前HPSE的抑制剂主要有以下几类：1）寡糖类抑制剂主要有PI-88及其衍生物，PI-88正申请进入Ⅲ期临床。PI-88可以抑制HPSE的活性，减少HS的释放，阻断HS与FGF-2的结合，从而遏制下游ERK1/2活性，导致细胞信号级联反应也被阻断。在RIP1-Tag2小鼠模型中，PI-88可以减少早期病变；PI-88还可以抑制胎盘血管增生；还可以减少上皮细胞中VEGF受体，从而减少肿瘤[24]增殖。2）肝素肝素，特别是小分子量的肝素可以增加癌症病人的存活率。肝素通过选择性抑制癌细胞板以及内皮细胞之间的相互作用，从而抑制细胞的侵袭和转移。但是肝素的抗凝性限制了它的抗癌作用，有人通过化学修饰得到了无抗凝性的肝素衍生物，可以考[25]虑在出现流血症状时适当加大用量，这种用药方式是比较安全的。3)苏拉明苏拉明是多磺化萘脲类化合物，10μmol/L苏拉明可以完全抑制人70W细胞的侵袭，但是苏拉明的神经以及肾毒性限制了它的作用。除了以上的3类物质可以对HPSE起作用，还有物质可以对HPSE起作用，如一[22]些天然抗体、中和抗体以及小分子物质。4HPSE真核以及原核表达虽然已经明确了HPSE在肿瘤转移中的相关作用，为了研究HPSE在肿瘤发生、肿瘤浸润、转移及血管生成中所起的作用，获得大量的HPSE以及其抗体，就显得很[26]有必要。高红伟等在大肠杆菌中成功地表达出不包含信号肽的重组人HPSE蛋白；[27][28]李燕杰等实现了人HPSE大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达；师红磊等在大肠杆菌中成功表达了人全长HPSE蛋白。国外有几家实验室成功在真核细胞中表达人肝[29-30][31-32]素酶，国内也有关于HPSE真核表达的报道，陈陵等构建了包含有HPSE全长片段的真核表达质粒，并先后成功转染转移能力不同的肺癌以及肝癌细胞，为进一3 广东药学院硕士研究生学位论文[33]步研究HPSE对肺癌、肝癌细胞转移能力的影响提供基础；刘至玄等从HepG2细胞中克隆出全长HPSEcDNA后，用限制性内切酶去掉信号肽部分，将该片段与pGEM-Teasy载体连接，然后将重组真核表达质粒转入毕赤酵母菌表达体系，经甲醇[34]诱导表达蛋白；季颖等亦通过真核表达得到HPSE大亚基蛋白。5抗HPSE单克隆抗体的应用以及研究现状HPSE与肿瘤发生、发展密切相关，是肿瘤诊断、预后判定和决定治疗方案的重要参考因素。MMPs与HPSE都能降解BM和ECM，过去10多年中，曾经尝试以ECM中的结构蛋白成分为底物开发MMPs抑制剂，但由于多达26种以上MMPs的相互代偿作用，单一的抑制剂在临床上难以很好地发挥作用。HPSE作为唯一能降解ECM蛋白多糖成分的内切糖苷酶，其抑制剂将能明显减少肿瘤细胞的生长与转移，因此，设计和合成HPSE抑制剂的研究在国际抗癌新药研究领域进展迅速。由于单抗药物有明确的靶向性、作用机制明确、疗效好和副作用小的优点，以肿瘤细胞受体、关键基因[35]和调控分子为靶点的新型单抗性药物越来越多的被应用于临床。可以将人源化肝素酶单克隆抗体作为靶向药物的导向物，引导抗肿瘤药物到达肿瘤病灶发挥疗效，但是[36]有关HPSE抗体的抗肿瘤治疗目前报导很少。利用抗HPSE单克隆抗体建立一种简单灵敏的检测患者血清、排泄物、肿瘤组织中肝素酶表达水平的方法，将有助于肿瘤[37]的临床诊断和预后判断，关于血清中HPSE水平检测仅有少量报道。国内关于HPSE单克隆抗体的制备，主要的方法是先克隆得到表达HPSE蛋白的基因片段（全长或某一段基因），通过真核或者原核表达得到抗原，再用抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂[28,38-39][40]交瘤技术得到单克隆抗体。李素波等运用了一种新型的方法也成功制备出了HPSE多克隆抗体，他们用自己实验室构建的表达肝素酶全长质pcDNA3.1(+)-HPSE为基因免疫载体，免疫BALB/c小鼠，使得质粒上的目的基因在动物体内表达，诱导动物体对DNA编码的外源蛋白产生抗体而获得肝素酶的抗血清，通过间接ELISA方法测定小鼠抗血清效价，Western印迹鉴定抗血清特异性，获得了效价较高的小鼠抗血清。目前还未见抗HPSE的单克隆抗体等中和抗体的研究报道，本研究的目的在于成功克隆HPSE基因全长片段，通过原核表达得到该全长基因片段编码的人HPSE，用4 广东药学院硕士研究生学位论文158172人全长HPSE蛋白、重组人HPSE50kDa蛋白以及Lys-Asp多肽筛选抗HPSE单158172158162克隆抗体。所用多肽Lys-Asp包含HPSE的肝素结合位点Lys-Asp，从而筛选出可以与HPSE活性位点结合的抗HPSE单克隆抗体，抗HPSE单克隆抗体与HPSE的活性位点结合，阻断HPSE与肝素的结合，从而抑制HPSE的促肿瘤发生发展与转158162移。成功制备针对肝素结合位点Lys-Asp抗HPSE单克隆抗体，可以为进一步研究HPSE在肿瘤转移中的作用机制、研制抗肿瘤转移中和抗体药物、研制检测肿瘤病人HPSE试剂奠定基础。5 广东药学院硕士研究生学位论文第一部分HPSE原核表达系统的构建以及表达条件优化1实验材料1.1质粒和菌株1）质粒：包含HPSE全长片段的pOTB7质粒购于广州复能基因有限公司，原核表达质粒pET28a(+)质粒为本实验室保存。2）菌株：E.coliBL21（DE3）、DH5α为本实验室保存。1.2主要试剂1）酶：限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ以及T4DNALigase为TaRaKa公司产品。2）试剂盒：胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒为BIOTEKE公司产品。1.3溶液配制1)细菌培养以及蛋白诱导相关①LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，加入800mldH2O，搅拌溶解，用5mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，加dH2O定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。②LB/Kana培养基：高压灭菌后LB培养基中无菌条件下加入0.22μm滤膜过滤除菌的卡那霉素（Kana），Kana终浓度为50μg/ml。③LB平板：配制好的LB培养基中加入琼脂粉，15g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min,冷却至50℃～60℃时净化工作台中迅速倒平板，平板凝固后倒置于4℃保存。④LB/Kana平板：制备LB平板时待培养基冷却至40℃~50℃时，加入kana，使其终浓度为50μg/ml，倒平板，待平板凝固后倒置于4℃保存。⑤2×YT培养基：胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl5g，加800mldH2O，搅拌溶解，5mol/LNaOH溶液调pH至7.0，加dH2O定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌。⑥5%葡萄糖的LB培养基（LB+G）：5g葡萄糖溶于100mlLB液体培养基中。⑦100mmol/LIPTG储存液：准确称取0.24gIPTG粉末，加入dH2O溶解，定容至6 广东药学院硕士研究生学位论文10ml，0.22μm滤膜除菌。2)琼脂糖凝胶电泳相关①50×TAE电泳缓冲液：Tris242g，EDTA37.2g，冰醋酸57.1ml，加700mldH2O，调节pH至8.5。②琼脂糖凝胶：根据需要在1×TAE电泳缓冲液中加入相应量的琼脂糖，加热煮沸使琼脂糖溶解，冷却至50℃左右加入EB至0.5μg/ml，倒入电泳槽模具凝固。3)SDS-PAGE凝胶电泳相关①30%胶储备液：0.9g甲叉双丙烯酰胺（Bis），29.1g丙烯酰胺（Arc），dH2O溶解，定容至100ml，0.45μm滤膜过滤，4℃保存。②1.5mol/LTris-HCl：Tris36.34g，加dH2O溶解，6mol/LHCl调pH至8.8，dH2O定容至100ml，储存于4℃冰箱中。③1mol/LTris-HCl（pH6.8）：Tris12.11g加dH2O溶解，用6mol/LHCl调pH至6.8，定容至100ml，储存于4℃冰箱中。④10%SDS：称取5gSDS，加入约35mldH2O，65℃加热助溶，dH2O定容至50ml。⑤10%过硫酸铵（AP）：称取0.1gAP，倒入1.5mlEP管中，用移液枪加dH2O1.0ml，溶解即可，做好标记。备注：AP放置时间不宜过长，最好现配现用。⑥电泳缓冲液：Tris1.5g，Gly7.2g，SDS0.5g，加水定容至500ml。⑦SDS上样缓冲液：5.3mlddH2O中加入1.2mlpH6.8Tris-HCl，1.0ml甘油，2ml10%SDS，0.5ml的溴酚蓝溶液（0.5g/LW/V）。⑧考马斯亮兰染色液：称取考马斯亮兰R-2500.05g，溶解于100ml脱色液中，摇匀使之全部溶解。⑨脱色液：250ml甲醇，80ml冰乙酸，再加dH2O定容至1L。4)裂解液相关①0.1mol/LPB，pH7.4：取9.5ml0.2mol/LNaH2PO4缓冲液和40.5ml0.2molNa2HPO4缓冲液，加水定容至100ml。②0.01mol/LPBS，pH7.4：NaCl8.0g，KCl0.20g，NaH2PO42.93g，Na2HPO4·12H2O2.90g，加入800mldH2O使其溶解，1mol/LNaOH调pH至7.4，再加入dH2O，用容量瓶定容至1L；③菌体裂解液：50mmol/LPBS，pH7.4，100mmol/L。7 广东药学院硕士研究生学位论文④包涵体裂解液：50mmol/LPBS，pH7.4，100mmol/LNaCl，8mol/L尿素。5）包涵体洗涤液①洗涤液Ⅰ：50mmol/LPBS，pH7.4,2%TritonX-100,100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA。②洗涤液Ⅱ：50mmol/LPBS，pH7.4,1%tritonX-100,100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA。③洗涤液Ⅲ：50mmol/LPBS，pH7.4,100mmol/LNaCl，1mol/L尿素。④洗涤液Ⅳ：50mmol/LPBS，pH7.4,100mmol/LNaCl，2mol/L尿素。7）HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白相关溶液①平衡缓冲液：20mmol/LPB，pH7.4，0.5mol/LNaCl，5mmol/L咪唑，8mol/L尿素。②洗脱缓冲液Ⅰ：20mmol/LPB，pH7.4，0.5mol/LNaCl，100mmol/L咪唑，8mol/L尿素。③洗脱缓冲液Ⅱ：20mmol/LPB，pH7.4，0.5mol/LNaCl，500mmol/L咪唑，8mol/L尿素。1.4主要设备HH-1水浴箱江苏金坛市宏华仪器厂H1650-W台式高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司JY88-II超声波细胞粉碎机宁波科生仪器厂JY-SP-C型电泳仪君意东方电泳设备有限公司2720型PCR仪美国ABI公司THZ-051型高精度数控摇床SHENRGYBIOCOZOR气浴恒温振荡器江苏省金坛市宏华仪器厂ZF5型手提式紫外分析仪上海嘉鹏科技有限公司微波炉Galanz电磁炉坂田电子天平DENVER电热恒温培养箱宁波江南仪器厂全自动数码凝胶图像分析系统Tanon8 广东药学院硕士研究生学位论文HV-50型全自动高压灭菌锅HIRAYAMA公司低温冰箱伊莱克斯THL-16G型台式离心机上海安亭科学仪器厂SW-CJ-IF型净化工作台苏州净化制备有限公司J-25离心机Beckman公司HL-2恒流泵上海青浦沪西仪器厂核酸蛋白检测仪上海青浦沪西仪器厂2实验方法2.1目的DNA的扩增2.1.1引物设计及合成根据NCBIGenBank（GenBankAccessionNo.NM_001098540）提供的人HPSEcDNA序列，设计合成PCR引物，用于扩增人HPSE，扩增得到的HPSE核酸序列包含信号肽以及C-端1个His-tag，并引入EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，长度为1769bp，编码549个氨基酸，推算相对分子质量约为62.0kDa。上游引物：TATTCCATGGGCATGCTGCTGCGCTCGAAGC(NcoI)，下游引物：CGCCTCGAGTCAGATGCAAGCAGCAACTTTG(XhoI)；2.1.2PCR扩增目的DNAPCR反应体系如下：5×PCRBuffer10μl5’引物0.5μl3’引物0.5μlpOTB7质粒(模板)0.1μldNTPmixtures4.0μlSTARHSenzyme0.3μlddH2O34.6μl总体积50.0μl9 广东药学院硕士研究生学位论文按照以下条件进行PCR扩增：94℃1min;94℃30s，60℃30s，30个循环72℃2min；72℃10min;4℃保存2.1.3琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物按照DNA实际分子量称取适量的琼脂糖，加入1×TAE，加热使琼脂糖完全溶解，溶液温度下降到约50℃，加入EB，混匀，倒入模具槽中，冷却凝固后放入电泳池，在电泳池中加入1×TAE电泳缓冲液，高出凝胶液面2mm左右。取PCR产物，与6×上样缓冲液轻轻混匀，在每个上样孔加入6μl混匀后样品，其中一个上样孔中加入DNA分子量标准品。100V恒压电泳，待溴酚蓝前沿到达凝胶的2/3左右时停止电泳，凝胶成像系统分析电泳结果。2.1.4回收目的DNA片段按照BIOTEKE公司琼脂糖凝胶回收试剂盒实验步骤操作，对扩增出来的目的条带进行纯化回收。琼脂糖凝胶电泳分析回收情况。2.1.5人HPSE目的片段双酶切与酶切产物回收按照以下条件对扩增纯化的人HPSEDNA片段进行双酶切。10×bufferH3μlEcoRⅠ3μlXhoⅠ3μlHPSEPCR回收产物15μl灭菌ddH2O6μl总体积30μl37℃过夜。10 广东药学院硕士研究生学位论文琼脂糖凝胶电泳检测分析HPSE目的片段双酶切产物，按照BIOTEKE公司琼脂糖凝胶回收试剂盒实验步骤操作，对片段双酶切产物进行纯化回收。2.2原核表达载体的准备2.2.1pET-28a(+)菌种活化无菌条件下，灭菌试管中依次加入：2×YT培养基5ml卡那霉素（50mg/ml）5μlpET-28a(+)菌种（-20℃保存）5μl170rpm，37℃条件下振荡，过夜培养。2.2.2pET-28a(+)质粒提取取过夜培养的菌液至1.5mlEP管中，离心（12000rpm,1min），菌液超过1.5ml时，可分多次加入。然后按BIOTEKE高纯质粒小量试剂盒说明操作。琼脂糖凝胶电泳检测所提取的pET-28a(+)质粒。2.2.3pET-28a(+)质粒双酶切10×bufferH5μlEcoRⅠ4μlXhoⅠ4μlpET-28a(+)质粒30μl灭菌ddH2O7μl总体积50μl37℃过夜。琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。2.2.4酶切质粒的回收按照BIOTEKE公司琼脂糖凝胶回收试剂盒实验步骤操作，对酶切质粒进行纯化回收，琼脂糖凝胶电泳分析回收情况。11 广东药学院硕士研究生学位论文2.3.pET-28a(+)-HPSE的克隆和鉴定2.3.1人HPSE和pET-28a(+)质粒双酶切产物的连接按照以下条件对人HPSE和pET-28a(+)质粒双酶切产物进行连接。HPSE片段6μlpET-28a(+)质粒片段2μl10×LigaseBuffer5μlT4DNALigase2μlddH2O35μl总体积50μl16℃过夜，约12h。[41]2.3.2E.coliDH5α感受态细胞的制备1）取E.coliDH5α菌液（含20%甘油，保存于-80℃）三线法划LB/Kana平板培养基，37℃恒温过夜培养；2）挑取单菌落至3mlLB/Kana液体培养基中，37℃、170rpm过夜培养；3）取40μl接种于40ml的LB/Kana液体培养基，培养至OD600≈0.6，收集菌液，冰上放置10ml，4℃，2500rpm离心5min，弃上清；4）沉淀用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min，4℃，3500rpm离心5min，弃上清；5）沉淀用1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬，分装成200μl每管于-80℃冻存。[41]2.3.3感受态细胞的冻存1）感受态细胞中加入3.5%DMSO，冰上放置15min；2）再加入3.5%DMSO，冰上放置15min，冰上分装，于-80℃保存。注意：有条件的在分装后最好置于液氮中使其迅速冻结，再置于-80℃保存。也可以加入甘油冻存感受态细胞，甘油的终浓度为50%。一般情况下，没加甘油的感受态细胞在4℃可以保存一周，加了甘油的在-20℃条件下可以保存一个月，-80℃条件下可以保存很长时间。12 广东药学院硕士研究生学位论文[41]2.3.4.转化1）1.5ml灭菌EP管中加入100μlDH5α感受态细胞和10μl重组质粒，冰浴30min；2）42℃水浴90s；3）冰上放置2min；4）EP管中再加入600μlLB培养液，37℃、170rpm震荡培养45min；5）3500rpm离心5min,弃部分上清，余下的涂布于含有Kana（50mg/ml）的LB平板上。共设置四组：①E.coliDH5α感受态细胞②E.coliDH5α（pET-28a(+)）-HPSE)重组菌③pET-28a(+)双酶切产物组④pET-28a(+)质粒组2.3.5pET-28a(+)-HPSE重组质粒的鉴定2.3.5.1pET-28a(+)-HPSE重组质粒PCR1)转化后第二天取出培养皿，挑取白色单克隆菌落，加入到装有3mlLB（含Kana）培养基的试管中，37℃、170rpm过夜培养；2)取200μl扩增的E.coliDH5α(pET-28a(+)-HPSE)菌液，煮沸15min，4000rpm离心5min，取上清作为PCR反应的模板；3)所设计的PCR引物上游序列：GTGATGAGGCAAGTATTCTTTGG，下游序列：TCAGATGCAAGCAGCAACTTTG，扩增出来的产物是HPSE的一个片段，长度为495bp；13 广东药学院硕士研究生学位论文4）PCR反应体系为：10×PCRBuffer2μl3’引物0.4μl5’引物0.4μl模板（上述菌液上清）0.3μldNTPmixtures3.2μlrTaqenzyme0.2μlddH2O13.5μl总体积20.0μlPCR反应的条件为：94℃5min；94℃45s，58℃30s，30个循环72℃1min；72℃10min；4℃保存1.2%琼脂糖凝胶电泳验证HPSEPCR产物和预期扩增的PCR产物大小是否一致。2.3.5.2pET-28a(+)-HPSE重组质粒双酶切鉴定1)挑取PCR阳性的白色单克隆菌落，加入到装有3mlLB（含Kana）培养基的试管中，37℃、170rpm过夜培养；2）将扩增的E.coliDH5α(pET-28a(+)-HPSE)菌液10000rpm离心1min，收集沉淀的菌体；3）按BIOTEKE高纯质粒小量试剂盒说明书操作提取质粒。4）将提取的pET-28a(+)-HPSE质粒进行EcoRI/XhoI双酶切鉴定，查看电泳片段与理论是否一致。然后选取鉴定正确的质粒进行DNA序列分析，测序工作交由华大基因公司完成。对测序正确的菌株进行保种，含20%甘油，保存于-20℃或-80℃。14 广东药学院硕士研究生学位论文2.4.重组人HPSE菌株的诱导表达及条件优化2.4.1E.coliBL21（DE3）感受态细胞的制备以及冻存具体方法同E.coliDH5α感受态细胞的制备以及冻存。2.4.2测序正确的pET-28a(+)-HPSE重组质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞1）从测序正确的菌株中提取重组质粒，方法同2.2.2；2）再将其转入到E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，具体方法同重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞。2.4.3重组人HPSE菌株的诱导表达1)转化后第二天取出培养皿，挑取白色单克隆菌落，加入到装有5mlLB/Kana液体培养基的试管中，37℃、170rpm培养；2）培养至至OD600≈0.6时，取出1ml菌液作为诱导前对照，余下的加入4μl1mmol/LIPTG溶液，37℃、170rpm诱导培养6h，取出1ml诱导后菌液；3）诱导前和诱导后的菌液，10000rpm离心1min。取20μl上清，上清中加入20μl2×SDS上样缓冲液；沉淀的菌体中加入50μl2×SDS上样缓冲液。各样品煮沸5min，10000rpm离心5min，SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达情况。4）SDS-PAGE凝胶电泳：准备好制备凝胶用的玻璃板，将分离胶灌入玻璃板中，用dH2O封胶，待胶凝固后，再灌入浓缩胶，插上梳子。浓缩胶凝固后，组装好电泳装置，加入SDS电泳缓冲液，拔下梳子，上样，进行电泳，电泳条件是：浓缩胶80V恒压、分离胶120V恒压。分离胶以及浓缩胶配方如下：10%分离胶（5ml）5%浓缩胶（2ml）1.9mlddH2O1.40mlddH2O1.7ml30%胶贮液(Acry)0.33ml30%胶贮液(Acry)1.3mlpH8.8Tris-Hcl缓冲液0.25mlpH6.8Tris-Hcl缓冲液0.05ml10%SDS0.02ml10%SDS0.05ml10%AP0.02ml10%AP2μlTEMED2μlTEMED15 广东药学院硕士研究生学位论文5）对能稳定诱导表达出人HPSE蛋白的菌株进行保种，含20%甘油，保存于-20℃或-80℃。2.4.4重组人E.coliBL21（DE3，pET-28a(+)-HPSE）工程菌最佳诱导条件的优化2.4.4.1最佳表达时间的确定重组人E.coliBL21（DE3，pET-28a(+)-HPSE）工程菌过夜活化，按1%的比例接种，37℃、170rpm培养至OD600≈0.6，取1ml作诱导前对照，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，在37℃、170rpm诱导培养，于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h时各取出1ml样品，SDS-PAGE凝胶电泳比较不同诱导时间目的蛋白的表达情况。2.4.4.2最佳IPTG浓度的确定重组工程菌过夜活化，按1%的比例接种，37℃、170rpm培养至OD600≈0.6，取1ml作诱导前对照，加入不同量的IPTG，使其终浓度分别为：0mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L，37℃、170rpm培养6h后，SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况。2.4.4.3最佳培养基的确定在使用不同培养基（LB、LB+0.5%葡萄糖、2×YT）的条件下，按常规方法诱导E.coliBL21（DE3，pET-28a(+)-HPSE）重组工程菌的表达，所用IPTG的浓度为1mmol/L，加入IPTG后再诱导5h。SDS-PAGE凝胶电泳比较使用不同培养基时目的蛋白的表达情况。2.5.重组人HPSE蛋白的表达形式的确定重组工程菌过夜活化，按1%的比例接种，在探索出的最佳条件下诱导人HPSE蛋白的表达，5000rpm离心10min收集菌体，超声破碎仪裂解菌体，10000rpm离心10min，分别取细菌上清和沉淀，再加入2×SDS上样缓冲液，10%SDS-PAGE电泳鉴定其表达形式。16 广东药学院硕士研究生学位论文2.6.重组人HPSE蛋白的纯化2.6.1重组人HPSE包涵体的超声破碎以及洗涤1）诱导后菌液，5000rpm离心10min，弃上清，称取菌体质量；2）菌体以10倍体积的超声裂解液重悬，超声破碎（500W，工作2s，间歇2s，工作30min），破菌完全后于4℃，10000rpm离心10min。留取上清，取40μl上清，加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为超声裂解后的上清样品。称取包涵体的质量；3）沉淀中加入100倍体积的洗涤缓冲液Ⅰ，冰浴条件下，磁力梯度混合器搅拌10min。取40μl样品，样品中加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为超声后沉淀样品。余下的4℃，10000rpm离心10min。留取上清，取40μl上清，加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤1次后的上清样品；4）沉淀中加入与洗涤液Ⅰ相同体积的洗涤液Ⅱ，冰浴条件下，磁力梯度混合器搅拌10min。取40μl样品，样品中加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤1次后的沉淀样品。余下的4℃，10000rpm离心10min。留取上清，取40μl上清，加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤2次后的上清样品；5）沉淀中加入与洗涤液Ⅰ相同体积的洗涤液Ⅲ，冰浴条件下，磁力梯度混合器搅拌10min。取40μl样品，样品中加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤2次后的样品。余下的4℃，10000rpm离心0min。留取上清，取40μl上清，加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤3次后的上清样品；6）沉淀中加入与洗涤液Ⅰ相同体积的洗涤液Ⅲ，冰浴条件下，磁力梯度混合器搅拌10min。取40μl样品，样品中加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤3次后的沉淀样品。余下的4℃，10000rpm离心10min。留取上清，取40μl上清，加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤4次后的上清样品7）根据蛋白表达情况在沉淀中加入适量包涵体裂解液，磁力梯度混合器搅拌过夜。取40μl样品，样品中加入40μl2×SDS上样缓冲液，作为洗涤4次后的沉淀样品。余下的样品可保存于-20℃；8）SDS-PAGE凝胶电泳检测各组样品。17 广东药学院硕士研究生学位论文2.6.2HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白1)包涵体裂解后的溶液用0.45μm的滤膜进行过滤；2)恒流泵调到1ml/min，10柱体积（columnvolume，CV）ddH2O清洗HisTrapTMcrude柱，除掉乙醇；3)注入1CVNiSO4；4)10CVddH2O清洗HisTrapTMcrude柱，除掉多于的NiSO4；5)平衡缓冲液平衡HisTrapTMcrude柱；6）上样，即包涵体裂解后的滤液；7）平衡缓冲液冲平；8）洗脱液Ⅰ洗脱，去除与柱子结合不牢的杂蛋白；9）洗脱液Ⅱ洗脱；10）10CVddH2O清洗HisTrapTMcrude柱；11）5CV20%乙醇封柱；12）SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯化情况。3结果3.1人HPSE以及质粒相关结果3.1.1人HPSE全长片段的扩增与鉴定PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，可见大小约1600bp的产物，与人HPSE蛋白编码序列cDNA长度基本相符(图1)18 广东药学院硕士研究生学位论文12Marker2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图1HPSEPCR扩增产物电泳图Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofHPSE1.HPSE扩增产物；2.DNA标准品DL20001.PCRproductsofHPSE;2.DL2000DNAmarker3.1.2pET28a(+)质粒的鉴定所提的质粒进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见3条条带，第1条为超螺旋，即质粒的两条链都没有断裂；第二条为松弛环状分子，即质粒有一条链断裂的开环DNA，第3条带为线性分子，即质粒的两条链都断裂的线形DNA。从条带亮度判断出质粒浓度较高（图2），可进行下一步实验。12Marker15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp图2pET28a(+)质粒电泳图Fig.2AgarosegelelectrophoresisofpET28a(+)1.DNA标准品DL15000；2.pET28a(+)质粒1.DL15000DNAmarker;2.pET28a(+)19 广东药学院硕士研究生学位论文3.1.3pET28a(+)质粒以及人全长HPSEcDNA双酶切鉴定对pET28a(+)质粒以及人全长HPSEcDNA双酶切产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见大小约1600bp以及5000bp的产物，这与人全长HPSEcDNA片段以及pET28a(+)质粒实际长度相符，从电泳结果可见pET28a(+)酶切片段的光密度约为HPSE酶切片段的2倍，已知pET28a(+)酶切片段的分子质量约为HPSE分子量的3倍（图3），为确保连接效果，故连接时选择HPSE与pET28a(+)酶切片段的体积比为3:1。123Marker15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bp图3pET28a(+)质粒以及全长HPSE双酶切产物Fig.3AgarosegelelectrophoresisofdoubleenzymeproductsofHPSEandpET28a(+)1.HPSE双酶切产物；2.DNA标准品DL15000；3.pET28a(+)质粒双酶切产物1.DoubleenzymedigestionofHPSE;2.DL15000DNAmarker;3.DoubleenzymedigestionofpET28a(+)20 广东药学院硕士研究生学位论文3.1.4重组质粒PCR鉴定总共挑取9个单菌落过夜培养，OD600检测发现只有4个菌液浓度相对较高，故选取这四个进行菌液PCR鉴定。对PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，可见有两个出现目的条带（图4），选取这两个进行双酶切鉴定。Marker123452000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图4重组质粒的PCR扩增电泳图Fig.4AgarosegelelectrophoresisofPCRofrecombinantplasmids1.DNA标准品DL2000；2、3、4、5分别为样品①②③④1.DL2000DNAmarker;2,3,4,and5arePCRproductsofrecombinantplasmids①,②,③,and④21 广东药学院硕士研究生学位论文3.1.5重组质粒双酶切鉴定PCR阳性的菌落进行双酶切，对双酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，可见样品③既有HPSE全长片段，又有质粒片段，而样品④仅有质粒片段（图5），故而选择样品③进行测序。12345Marker15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp图5重组质粒双酶切电泳Fig.5Agarosegelelectrophoresisofdoubleenzymedigestionofrecombinantplasmid1.DNA标准品DL15000；2、3分别为样品③④；4.连接前的HPSE全长片段；5.连接前的pET28a(+)质粒片段1.DL15000DNAmarker;2and3aredoubleenzymedigestionsofrecombinantplasmids③and④;4.Doubleenzymedigestionoffull-lengthHPSEbeforeligation;5.Doubleenzymedigestionsafterligation22 广东药学院硕士研究生学位论文3.2人HPSE蛋白表达结果3.2.1人HPSE蛋白在原核细胞中的表达将测序正确的重组质粒转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，用1mmol/LIPTG诱导6h后，SDS-PAGE电泳检测，发现诱导后的在约62kDa处多出一条条带，条带大小与目的蛋白大小相符（图6）。12397.2kDa66.4kDa目的条带→44.3kDa20.1kDa图6SDS-PAGE检测人重组HPSE蛋白的表达Fig.6SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofrecombinantHPSEprotein1.诱导后；2.诱导前；3.蛋白标准品1.SDS-PAGEanalysisofE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)afterinducing;2.SDS-PAGEanalysisofE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)beforeinducing;3.Proteinmarker23 广东药学院硕士研究生学位论文3.2.2人HPSE蛋白最佳表达条件的优化3.2.2.1不同IPTG浓度诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测确认重组工程菌E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)可以表达HPSE蛋白后，首先探索诱导剂IPTG的浓度对HPSE蛋白表达量的影响，SDS-PAGE电泳检测（图7）发现，当IPTG浓度为1.0mm/L时HPSE蛋白表达量。12345678997.2kDa66.4kDa目的条带44.3kDa29.0kDa20.1kDa14.3kDa图7不同IPTG浓度诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测Fig.7SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofrecombinantHPSEproteinwithdifferentconcentrationofIPTG.1.E.coliBL21(DE3，pET28a(+))，IPTG浓度为1mmol/L；2.E.coliBL21(DE3，pET28a(+))，未加IPTG；3、4、5、6、7、8.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)，加入的IPTG终浓度分别是3.0mmol/L、2.0mmol/L、1.0mmol/L、0.8mmol/L、0.5mmol/L、0mmol/L；9.蛋白标准品1.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)),withIPTGwhoseconcentrationwas1mmol/L;2.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)),withoutIPTG；3,4,5,6,7,8.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)，withIPTGwhoseconcentrationwere3.0mmol/L,2.0mmol/L,1.0mmol/L,0.8mmol/L,0.5mmol/L,0mmol/L，respectively;9.Proteinmarker24 广东药学院硕士研究生学位论文3.2.2.2不同诱导时间诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测在E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)工程菌中加入IPTG的终浓度均为1mmol/L时，改变诱导的时间，SDS-PAGE电泳检测（图8）发现，诱导5h重组人HPSE蛋白表达量最大，故选择5h作为最佳表达时间。12345678910111297.2kDa66.4kDa目的蛋白44.3kDa29.0kDa图8不同诱导时间诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测Fig.8SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofrecombinantHPSEproteinwithdifferentinductionperiod1至10为E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)，加入IPTG的终浓度均为1mmol/L，诱导时间分别为20h,9h,8h,7h,6h,5h,4h,3h,2h和1h；11为E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)，未加IPTG诱导；12为蛋白标准品1to10.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)withtheconcentrationofIPTG1mmol/L,afterinducing20h,9h,8h,7h,6h,5h,4h,3h,2h,1h,respectively;11.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)withoutIPTG;12.Proteinmarker25 广东药学院硕士研究生学位论文3.2.2.3不同培养基诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测由图9结果可见，在2×YT培养基中HPSE蛋白表达量最高。12345678910Maker97.2kDa66.4kDa目的条带44.3kDa29.0kDa20.1kDa14.3kDa图9重组人HPSESDS-PAGE电泳图9不同培养基诱导表达菌SDS-PAGE蛋白电泳检测Fig.9SDS-PAGEanalysisoftheexpressionofHPSEproteinincubatedindifferentmedia1.超声破碎沉淀；2.为超声破碎上清；3.菌液上清；4.标准蛋白分子量；5.2×YT中IPTG诱导；6.2×YT中没有IPTG诱导；7.LB+G中IPTG诱导；8.LB+G中没有IPTG诱导；9.LB中有IPTG诱导；10.LB中没有IPTG诱导1.Ultrasonicprecipitation;2.Ultrasonicsupernatant;3.Bacteriasupernatant;4.Proteinmarker;5.InducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)in2×YTmedia;6.NotinducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)in2×YTmedia;7.InducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)in(LB+G)media;8.NotinducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)in(LB+G)media;9.InducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)inLBmedia;10.NotinducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)inLBmedia26 广东药学院硕士研究生学位论文3.3重组人HPSE纯化相关结果3.3.1包涵体纯化结果由图10-1和10-2可见包涵体经包涵体洗涤液洗涤两次后可去除部分杂蛋白，得到纯度较高的人HPSE蛋白；洗涤3次后反而有更多杂蛋白，洗涤4次后效果也不好。所以包涵体在用包涵体洗涤液Ⅰ、Ⅱ洗涤2次后，直接用包涵体裂解液裂解，再用于下一步纯化实验。123456797.2kDa66.6kDa目的条带44.3kDa29.0kDa20.1kDa14.3kDa图10-1SDS-PAGE检测超声以及洗涤液洗涤后的重组人HPSE蛋白Fig.10-1SDS-PAGEanalysisoftheultrasonicandwashingproceduresofHPSEprotein1.诱导前菌体；2.IPTG诱导菌体；3.超声破碎沉淀；4.包涵体洗涤1次后沉淀；5.超声破碎上清；6.包涵体洗涤1次后上清；7.标准蛋白分子量1.E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE);2.InducedE.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE);3.Ultrasonicprecipitation;4.Theprecipitationofinclusionbodyafterwashing1time;5.Ultrasonicsupernatant;6.Thesupernatantofinclusionbodyafterwashing1time;7.Proteinmarker.27 广东药学院硕士研究生学位论文12345678997.2kDa66.4kDa目的条带44.3kDa29.0kDa20.1kDa14.3kDa图10-2SDS-PAGE检测洗涤后的重组人HPSEFig.10-2SDS-PAGEanalysisofthedifferentwashingproceduresofHPSEprotein1.BSA；2.诱导前菌体；3.包涵体洗涤2次后沉淀；4.包涵体洗涤3次后沉淀；5.包涵体洗涤4次后沉淀；6.包涵体洗涤2次后上清；7.包涵体洗涤3次后上清；8..包涵体洗涤4次后上清；9.蛋白标准分子量1.BSA;2E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE);3Theprecipitationofinclusionbodyafterwashing2times;4.Theprecipitationofinclusionbodyafterwashing3times;5.Theprecipitationofinclusionbodyafterwashing4times;6.Thesupernatantofinclusionbodyafterwashing2times;7.Thesupernatantofinclusionbodyafterwashing3times;8.Thesupernatantofinclusionbodyafterwashing4times;9.Proteinmarker3.3.2HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白SDS-PAGE检测HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白（图11），可见在上样量约为15mg时，冲平时无目的蛋白被洗脱下来；当洗脱缓冲液中含有100mmol/L咪唑时，可以除去部分杂蛋白，且无目的蛋白被洗脱下来；当洗脱缓冲液中含有0.5mol/L咪唑时，目的蛋白被洗脱下来且无杂蛋白。说明洗脱条件符合纯化重组人HPSE蛋白。28 广东药学院硕士研究生学位论文123456797.2kDa66.4kDa44.3kDa20.1kDa图11HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白Fig.11SDS-PAGEanalysisofHPSEproteinafterpurificationbyHisTrapTMcrude1.BSA；2.上样和冲平混合液；3.洗脱缓冲液Ⅰ洗脱样品；4.洗脱缓冲液Ⅱ洗脱样品；5.洗脱缓冲液Ⅱ洗脱样品；6.洗脱缓冲液Ⅱ洗脱样品；7.蛋白标准品1.BSA;2.Themixtures;3.TheelusivesampleaftereluentingbyelutionbufferⅠ;4.TheelusivesampleaftereluentingbyelutionbufferⅡ;5.TheelusivesampleaftereluentingbyelutionbufferⅡ;6.TheelusivesampleaftereluentingbyelutionbufferⅡ;7.Proteinmarker4讨论(1)本课题拟制备抗HPSE单克隆抗体，因此先制备高纯度的HPSE蛋白作为免疫原。根据GenBank提供的HPSE全长基因序列设计引物，并将HPSE克隆到pET28a(+)载体上IPTG诱导蛋白表达后，收集菌体，超声裂解菌体后分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测到蛋白以包涵体的形式表达。包涵体表达的蛋白表达量一般比可溶性表达的蛋白表达量高，但是包涵体的纯化比较复杂。本研究对包涵体进行超声处理，并对超声产物进行洗涤，用以去除包涵体以外的杂质。8mol/L尿素裂解包涵体后，用HisTrapTMcrude柱对其进一步纯化，以得到高纯度的人HPSE蛋白。HisTrapTMcrude柱纯化重组人HPSE蛋白时选择PBS缓冲体系，因为Tris缓冲溶液会减弱C端带Histag的HPSE与HisTrapTMcrude柱的结合能力，使之不容易与杂蛋白分离开来。（2）为了提高全长人HPSE蛋白的表达量，本实验室还设计了另外一组引物用以克29 广东药学院硕士研究生学位论文隆全长HPSE基因，构建原核表达系统，以得到高表达量的全长人HPSE蛋白，该全长人HPSE蛋白的C-端、N-端各带一个His-tag。结果发现两端均带His-tag的表达系统表达的HPSE蛋白明显比C-端带His-tag的表达量高。实验过程中还探索了两种表达系统HPSE表达的最佳条件，结果C-端带His-tagHPSE的最佳表达条件为：IPTG的浓度为1mmol/L，诱导时间为5h，在2×YT培养基中诱导时目的蛋白表达量最高；C-端、N-端各带1个His-tag的HPSE的表达条件为IPTG浓度0.5mmol/L，诱导时间为4h时，在LB培养基中诱导表达的目的蛋白相对表达量最高。比较两组的诱导表达条件发现：C-端、N-端各带1个His-tag组所用IPTG浓度（0.5mmol/L）比C-端带His-tag组的IPTG浓度1mmol/L低，而且诱导表达4h就获得了比C-端带His-tag组诱导5h高的表达量。造成这种现象的原因有可能是因为两端带His-tag的HPSE比只有C-端带His-tag，更容易被诱导，因此需要较低浓度的IPTG及较短诱导时间，也有可能两端带His-tag的HPSE比只有C-端带His-tag的HPSE蛋白更稳定。(3)还可以设计一组只在N端带1个His-tag的原核表达系统。进一步的研究将系统比较C-端带1个His-tag、N端包含有1个His-tag和C-端、N-端均各带1个His-tag的表达水平，以便构建HPSE的高效表达系统，促进在体外研究HPSE的作用。30 广东药学院硕士研究生学位论文第二部分人HPSE单克隆抗体的制备1实验材料与仪器1.1实验动物昆明小鼠广州中医药大学实验动物中心BALB/c小鼠中山大学动物实验中心1.2实验用品弗氏完全佐剂Sigma公司（美国）弗氏不完全佐剂Sigma公司（美国）HPSE50kDa抗原由本实验室合成158172多肽（HPSELys-Cys）楚肽生物（上海）科技有限公司SP2/0骨髓瘤细胞本实验室保存新生牛血清浙江四季青生物技术公司RPMI-1640粉剂（1L×10）InvitrogenCorporation(GIBCO)聚乙二醇（PEG1450）Sigma公司（美国）HAT、HTSigma公司（美国）碳酸氢钠国药集团化学试剂有限公司DMSOSigma公司（美国）冻存管CorningIncorporated(COSTAR)玻璃培养瓶江苏海门有限公司12孔、24孔、96孔培养板CorningIncorporated(COSTAR)2ml、5ml、10ml刻度滴管江苏姜堰市桥东科教器皿厂25ml、50ml血清瓶广州康龙生物科技有限公司虹吸球广州富康医疗器械公司化玻有限公司6cm培养皿上海五一玻璃制品厂眼科手术剪、普通止血钳张家港市锦丰锦鹿刀剪厂31 广东药学院硕士研究生学位论文手术镊眼科广州康龙生物科技有限公司1ml、5ml卡介苗注射器上海注射器厂1ml、5ml一次性使用无菌注射器上海双鸽实业有限公司4号、6号、9号、16号注射针头长城医疗器械有限公司0.22μm、0.45μm微孔滤膜上海半岛实业有限净化器材厂1.3实验仪器CO2培养箱NAPCO酶标仪BIO-RAD培养基过滤器实验中心提供pH计METTLERTOLEDO紫外可见分光光度计AmershamBiosciencesSW-CJ-IF型净化工作台苏州净化制备有限公司倒置显微镜广州光学仪器有限公司1.4溶液配制1）培养基类：①将过滤器组装好，滤膜是0.22μm（在下）和0.44μm（在上），用布包好，1L的三角瓶装好超纯水并封好口，两者一起121℃高压湿热灭菌30min；待超纯水凉后，加入1包RPMI-1640干粉，同时还加入2gNaHCO3溶解其中，加入双抗（即Amp和Stp，两者加入的量均为0.1g/L），用HCl将pH值调为6.8～7.0，定容至1000ml；在已经紫外除菌的净化工作台中过滤培养基，过滤完后加少许到培养瓶中做无菌测试，余下的分装，4℃冰箱保存备用；②FBS的灭活：从-20℃中取出小牛血清，4℃溶解，然后56℃灭活30min，在已经紫外除菌的净化工作台中分装后保存于4℃备用；注意在4℃中保存最好不要超过1个月；③RPMI-1640完全培养基：按照实际需要在RPMI-1640培养基中加入适当比例的FBS；④细胞冻存液：50%RPMI-1640培养基，40%FBS，10%DMSO。2）ELISA用溶液：32 广东药学院硕士研究生学位论文①包被缓冲液（0.05mol/L，pH9.6CBS）：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加入800mldH2O使其溶解，调pH至9.6，再加入dH2O，用容量瓶定容至1L；②洗涤缓冲液：0.5ml的TWEEN-20溶于1L0.01mol/L，pH7.4PBS中；③抗体稀释缓冲液：1%BSA的0.01mol/L，pH7.4PBS溶液；④封闭液：含有2%BSA的0.01mol/L，pH7.4PBS溶液；⑤保护液：含有25g/L蔗糖的0.01mol/L，pH7.4PBS溶液；⑥终止液（2mo1/LH2SO4）：双蒸水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml；⑦显色A液：柠檬酸1.02g、磷酸氢二钠3.68g，加dH2O使其溶解，调pH值至4.8-5.0，再加入dH2O，用容量瓶定容至100ml，然后加入0.05g的非那西丁与0.1g的过氧化氢脲素，20ml分装，避光。⑧显色B液：TMB-HCl0.078g加入50ml的甲醇溶解，再加入50ml甘油混匀，加入300µL2mg/ml的Na2S2O3，分装，4℃避光保存。3）westernblot用溶液①SDS-PAGE电泳相关溶液见第一部分；③电转移缓冲液（0.025mol/LpH8.3Tris-Gly）：称取Tris3.875g、Gly19.3g，加入800mldH2O使其溶解，1mol/LHCl调pH至8.3，再加入dH2O，用容量瓶定容至1L，再加入200ml甲醇；④氨基黑10B脱色液：45ml甲醇，5ml冰醋酸，dH2O定容至100ml；⑤0.1%氨基黑10B溶液：称取0.2g氨基黑10B溶于200ml脱色液中，搅拌使其溶解完全，过滤后即可使用；⑥20mmol/LpH7.5TBS：称取Tris2.42g、NaCl19.3g，加入800mldH2O使其溶解，1mol/LHCl调pH至7.5，再加入dH2O，用容量瓶定容至1L；⑦洗涤缓冲液：0.25mlTWEEN-20溶于1L20mmol/LpH7.5TBS中；⑧封闭液：含3%BSA或3%明胶的20mmol/LpH7.5TBS；⑨抗体稀释液：即为封闭液；⑩DAB显色液：称取10mgDAB，加入1.25ml20mmol/LpH7.5TBS和25mldH2O，待DAB完全溶解后，加入9μL30%～40%H2O2混匀；注意应该避光操作。33 广东药学院硕士研究生学位论文2实验方法2.1BALB/c小鼠的免疫2.1.1免疫抗原的准备1）纯化的重组人HPSE50kDa蛋白从-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱解冻；2）然后将其加入透析袋中透析，透析所用溶液为0.01mol/L，pH7.4PBS，整个透析过程在4℃条件下进行，中间更换2-3次透析液；3）BCA法测定蛋白浓度，按照BIOTEKE的BCA试剂盒说明操作。2.1.2BALB/c小鼠的免疫1）4只6—8周龄BALB/c小鼠，尾静脉取血作为阴性对照；2）0天首次免疫，100μg/只(0.2m1),取500μl纯化的重组人HPSE50kDa蛋白，再加入等量弗氏完全佐剂，合适大小注射器反复抽打使其乳化，多点皮下注射和腹腔注射；3）两周后采用与第一次相同的抗原量与等量弗氏不完全佐剂进行第二次免疫；4）第二次免疫后第7天断尾取血，采用间接ELISA法测定血清效价，检测免疫效果，选定用效价最高的小鼠作为免疫脾细胞供体；5）融合前3天加强免疫，取相同量的抗原，进行尾静脉和腹腔注射。2.1.3间接ELISA法检测血清效价2.1.3.1最佳抗原包被浓度1）最佳二抗稀释度采用产品推荐的工作浓度l:2000；2）在96孔酶标板上进行方阵滴定，将重组人HPSE50kDa抗原以用包被缓冲溶液稀释成蛋白含量为1μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的溶液，每个浓度包被2行ELISA板；3）封闭液封闭；4）洗涤液洗涤掉多于抗原后，加入用抗体酶稀释液倍比稀释的阳性小鼠血清，稀释34 广东药学院硕士研究生学位论文比例为1:1000、1:2000、1:4000，直到1:256000；依次加入6个抗原浓度ELISA板中，每个抗原浓度均设置空白与阴性对照，按照常规ELISA法进行检测。5）选择阳性血清与阴性血清的比值(P/N)最大，线性最好，且OD450nm值接近于l的抗原浓度和抗体稀释比例作为间接ELISA反应体系的最佳抗原工作浓度。2.1.3.2血清抗体效价的测定：免疫一个月后，小鼠尾静脉取血，采用间接ELISA检测血清抗体效价。步骤如下：1)包被：包被液将抗原稀释为最佳工作浓度，即2.5μg/ml，每孔加100μl混合液，37℃孵育2h后，洗涤液洗涤3次，每次1min，甩干；2)封闭：已包被并甩干的酶标板每孔加入130μl封闭液，37℃温育2h（或者4℃过夜）；3）保护：将孵育2h后的酶标板拿出来，甩掉封闭液，甩干后，每孔加入150μl保护液，37℃孵育30min(或4℃过夜)。甩掉保护液，放在室温自然晾干密封，4℃保存备用；4)血清采集及稀释：捏住小鼠尾巴，75％酒精消毒，用剪刀剪去小鼠尾尖1-2mm，手指上下压迫小鼠尾巴取血，约取100μl，3000rpm离心15min，取上清分装保存。取1μl血清加入999μl抗体稀释液混匀，并进行倍比稀释。从1:1000到1:256000，共9个梯度；5)加样：取包被好的酶标板，每孔依次加入梯度稀释好的血清100μl，同时取小鼠免疫前的血清（1：1000稀释）做阴性对照，抗体稀释液做为空白对照。37℃孵育35min，洗涤3遍，每次1min，甩干；6)加入酶标二抗：HRP标记的羊抗小鼠IgG按照1：2000稀释，每个样品孔中加入100μl，37℃孵育35min，洗涤3遍，每次1min，甩干；7)显色：A、B显色液等体积混合后，每孔加入100μl，室温避光反应，显色时10min后，每孔中加入100μl终止液终止反应。8)终止读数：反应终止后，酶标仪读数。双波长450nm和630nm(参考滤光片波长）读数。以P/N≥2.1,即OD450nm大于2.1倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为血清的ELISA效价。如血清效价达1：10000以上，即可用于细胞融合。35 广东药学院硕士研究生学位论文2.2细胞融合相关物品以及细胞的准备2.2.1相关物品的准备1）无菌室、培养箱的消毒、灭菌要保证融合的成功，干净的环境是必不可少。在做细胞融合前，先把无菌室打扫干净。甲醛熏蒸前，新洁尔灭擦拭整个墙面、地板。①取新洁尔灭一份，加dH2O50份，配成0.1%的溶液，擦拭净化工作台、培养箱、玻璃、墙面、地板等，再用75%的酒精擦拭培养箱、超净工作台等；②甲醛熏蒸：用一次性杯子装上适量的高锰酸钾，在净化工作台内放一杯，细胞室内一杯，并把培养箱的门打开，离开前，在每个杯子中加入一定量的甲醛，密闭门窗，立即离去。24h后，把装有高锰酸钾和甲醛的杯子拿出来，自然通风驱散甲醛气体，也可用25%氨水加热蒸发中和30min。2）用品的准备细胞融合时需要用到的小镊子、止血钳、眼科剪、注射器、各种型号针头、离心管等放入铝制饭盒中，用布将饭盒包好，121℃高压湿热灭菌30min。2.2.2相关细胞的准备1）SP2/0细胞①SP2/0细胞的复苏：从液氮灌中快速拿出要复苏的细胞，迅速放到37℃－40℃的dH2O中水浴，不断摇动使其在1min内全部融化，以免细胞内形成冰晶对细胞造成不可逆的损伤。解冻后的细胞和冻存管一起放到10ml的离心管中1000rpm离心6min，净化工作台中弃掉上清，用含有10%FBS的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，再将重悬细胞转入50ml培养瓶中，加入完全培养基的量约为11ml，37℃、5%CO2条件下培养。也可以将解冻后的细胞直接转入含有15ml培养基的培养瓶中培养，第二天换液，将DMSO去掉。2）饲养层细胞在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。36 广东药学院硕士研究生学位论文66一只小鼠可获得5×10－8×10腹腔巨噬细胞。一只小鼠可铺2-3块96孔板，一般在融合前1-2天准备。其制备方法如下：①采用昆明小鼠来制备腹腔巨噬细胞，拉颈处死，浸泡于75％酒精，消毒5min。②用无菌止血钳在小鼠腹腔中部向两头拉，扯开腹部皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器注入5ml培养液，用手轻轻按摩腹部，吸出洗液放入50ml离心管中，如此反复2－3次，1000rpm离心6min，弃上清备用。③根据铺板数量加入适当RPMI-1640完全培养基重悬细胞，本次总共铺5块板，故加入45mlRPMI-1640完全培养基，再加入1ml50×HAT混匀。④将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，37℃、5％C02条件下培养。2.3细胞融合2.3.1SP2/0细胞的收集用移液管将处于对数生长期的骨髓瘤细胞轻轻吹下，收集于50ml的离心管中，并计算出总体积，吸取一滴用血球计数板计数，算出细胞总数，余下的1000rpm离心6min，弃去上清。7融合大概需6瓶左右铺满100ml培养瓶瓶底的SP2/0细胞量（6×10）。2.3.2脾细胞的制备1)在制备免疫脾细胞前，先眼球采血，待小鼠死亡后，用75%酒精浸泡消毒5min；2)将小鼠用针头固定在泡沫平板上，用止血钳在小鼠腹腔中部两端拉,将皮肤扯开，用无菌眼科剪剪开左侧腹膜，小心取出脾脏；3)将脾脏放在盛有10ml左右培养基的平皿中，轻轻洗涤，并把周围的结缔组织细心剥除干净，将脾脏移入另一个盛有培养基的平皿中洗涤，洗2－3次即可；4)把洗干净的脾脏放在绑有200目尼龙过滤网的小烧杯上，用眼科弯剪剪碎脾脏，用注射器反复研磨，培养基冲洗，使脾细胞滤入小烧杯中，收集脾细胞悬液，1500rpm离心6min，弃上清，再用30ml培养基重悬细胞，1000rpm离心6min。每只小鼠88可得1×10-2.5×10个脾细胞。37 广东药学院硕士研究生学位论文2.3.4细胞融合1）将收集好SP2/0细胞和脾细胞按照1：5的比例用30mlRPMI-1640不完全培养基重新悬浮至一个50ml离心管中，1000rpm离心6min，弃上清，要把残留的液体吸干净，以免降低PEG的浓度；2)轻轻弹击管底，使细胞团松散成糊状；3)移液管吸取1ml用37℃温热的PEG(45%,分子量为1450，含5%DMSO)溶液；4)在37℃水浴条件下较快的旋转离心管，同时在离离心管底2cm处沿离心管壁缓慢加入PEG，lmin左右加完，然再后静置90s。5)逐滴加入用37℃温热的不完全培养基30ml终止融合，第1、2、3、4、5min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，最后加入10ml，加入过程中速度先慢后快，动作要轻柔。6)800rpm离心5min，弃去上清，加入50ml含有HAT的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀。7)将融合细胞加入到已经铺有滋养细胞的96孔细胞培养板(一共5块)，每孔100μl，37℃、5％C02条件下培养。2.4杂交瘤的选择与克隆化2.4.1杂交瘤细胞的筛选脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞能在脾细胞中获得上述两种酶，在HAT选择培养液中可以生长繁殖。融合时加HAT培养液，3天后再换一次HAT培养液，之后更换HT培养液。融合后每隔3天对融合细胞进行换液，换液时弃掉一半旧的培养基，再加入新的培养基补足，第5天即可在倒置显微镜下观察到融合细胞生长情况，计算出融合率。融合后10天～14天，细胞克隆大小约为96孔板孔底面积的1/5-1/2，即可采用间接ELISA法(方法同血清抗体效价检测)检测各融合细胞培养上清液，以SP2/0培养上清为阴性对38 广东药学院硕士研究生学位论文照，筛选可以分泌目的抗体的阳性杂交瘤细胞，再进行克隆化培养。每一次筛选所用的抗原均为50kDa重组人HPSE与合成多肽，将两者检测结果都呈阳性的进行克隆。2.4.2阳性杂交瘤细胞的克隆化——有限稀释法筛选出阳性克隆后，立即采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养。1)从96孔板收集阳性克隆细胞并且计数；2)用不完全培养基将阳性克隆细胞稀释到100个/10ml，保证有单克隆生成；3)取一块预先己加有饲养层细胞（方法同本章2.2.2）的96孔细胞培养板，两种浓度细胞悬液各加半块细胞培养板，每孔加入100μl；4)将剩下的阳性克隆细胞转移到24孔板中，37℃、5％C02条件下扩大培养，收集细胞冻存。5)3天后倒置显微镜下观察克隆细胞生长情况，每隔3天－5天给细胞换一半培养基。6)约10天后，用ELISA法检测，并将OD450最高的阳性克隆再次克隆，直至细胞阳性率达100％，即可建株。7)保留建株的杂交瘤细胞株培养上清，可用测定抗体的亚基类型。2.4.3阳性杂交瘤细胞的冻存杂交瘤细胞一经建立应尽快冻存，以保证杂交瘤细胞不会因污染或异变而丢失。因此，对于阳性杂交瘤细胞的亲本细胞直至建株细胞都要冻存。冻存方法如下：①将生长旺盛、形态良好的待冻存杂交瘤细胞用移液管吹下至10ml离心管，1000rpm离心6min；②轻弹击离心管底，使细胞松动成糊状，将配好的细胞冻存液缓慢加入，并吹打均匀。6分装于2ml冻存管中，一般每支管装1ml，细胞数量3×0。③将细胞放在已恢复至室温的程序降温盒里，直接放进﹣80℃超低温冰箱冻存。2.5小鼠腹水单克隆抗体的制备1)BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油0.3ml/只；52)注射石蜡油1周后腹腔注射杂交瘤细胞，每只小鼠2.5×10个细胞；39 广东药学院硕士研究生学位论文3)约7天-10天后，小鼠腹部明显膨大，可采集腹水；4)左手固定小鼠，75%乙醇消毒其腹部，右手持灭菌注射针筒刺入小鼠下腹部，缓慢抽动。5)间隔2-3天，待腹水再累积后，同样方法再次抽取腹水，一次可抽取3-5ml，可抽取2-3次；6)收集完腹水后，3000rpm离心15min，分装后置于﹣20℃保存。2.6单克隆抗体小鼠抗体亚类鉴定(捕获ELISA法)1）包被：用包被缓冲液按1：1000比例稀释抗体(IgA，IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，每个孔中加入100μl稀释抗体，37℃孵育1h或者4℃过夜；2）洗涤：取出酶标板，弃去包被液，用洗涤液洗涤，每次静止3min，洗3次，再以自来水洗涤数次后拍干。3）封闭：用含有10g/L明胶的0.05mol/L，pH9.6CBS进行封闭，每孔100μl，37℃，1h或4℃过夜后取出拍干。4）保护：用含有25g/L蔗糖的0.01mol/L，pH7.4PBS进行保护，每孔100μl，37℃，30min或4℃过夜后拍干即可使用。5）加样：每孔加100μl待测样品(各抗体的培养上清、纯化后抗体均可，浓度大致为2-5μg/ml)，37℃孵育30min后洗涤，洗涤方法同上。6）加酶标抗体(即酶标抗鼠IgG)：于每孔内加入适当稀释的二抗(HRP标记羊抗鼠IgG抗体)100μl，室温温育30min。7）新鲜配制酶底物(显色液)，于每孔内加入100μl酶底物温育约20min-30min，直至孔内发生显色反应指示阳性结果。8）每孔加100μl终止液终止反应。9）酶标仪检测其450nm的吸光值。2.7HPSE单克隆抗体的纯化测得4D12和3F5两种抗体均为IgM，所以用以下方法对抗体进行纯化。[42]优球蛋白沉淀法：1）取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的终浓度分别达0.240 广东药学院硕士研究生学位论文mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；.2）经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的pH5.5dH2O透析，室温2h或4℃过夜，其间换水1次-2次。即可见白色沉淀产生；3）从透析袋中取出样品，8000g离心10min，弃上清；将沉淀溶于pH8.0的1mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；4）将沉淀溶于pH8.0的1mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl溶液中，浓度调整至5-10mg/ml。2.8HPSE单克隆抗体亲和常数的测定以三个不同浓度的50kDaHPSE蛋白(1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml)包被酶标[43]板，并将纯化后的单克隆抗体倍比稀释，利用Batty饱和法进行测定。分别以抗体浓度[Ab]为横坐标，以各浓度所对应的OD值为纵坐标，绘制“S”型曲线。找出各曲线上趋近平坦段的点，找出其ODmax值，并求出OD=1/2ODmax时的点相对应的抗体浓度，这样每份被检样品可得[Ab]t、[Ab’]t和[Ab”]t3个值，用以下公式求出三个Ka值，以其平均值为抗体的亲和常数。公式中的[Ab]和[Ab’]分别表示当抗原浓度为[Ag]和[Ag’]时，产生半数吸光值时抗体的浓度（mol/L），即1/2ODmax，n=[Ag]/[Ag’][44]。n-1Ka=2(n[Ab’]-[Ab])[42]2.9HPSE单克隆抗体特异性的鉴定1）SDS-PAGE凝胶电泳，步骤同第一部分4.3，每次两块胶，两块胶的上样顺序一样，上样顺序为：蛋白标准品、HPSE50kDa蛋白、全长HPSE蛋白。2）转膜：①根据凝胶的大小剪合适大小的PVDF膜，PVDF先用甲醇处理约90s，然后放入电转移缓冲液中平衡5min左右；②取下凝胶放入电转移缓冲液中平衡5min左右；41 广东药学院硕士研究生学位论文③从负极到正极，按照海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-凝胶的顺序摆放；④组装好整个装置，200mA恒流，1.5h。3）免疫反应：①用梳子比对转好的膜，将转好的PVDF膜上的蛋白Marker、以及（HPSE50kDa蛋白、全长HPSE蛋白）为一组的抗原裁剪下来；②封闭：取3组样品进行封闭，封闭液为3%BSA20mmol/LpH7.5TBS，37℃封闭1h；③一抗孵育：去掉封闭液，晾干，3组样品分别加入抗体酶稀释液（空白对照）、阴性血清（阴性对照）、4D12（1：200稀释）、3F5（1：800稀释），4℃过夜；④洗涤：洗涤液洗涤3次，每次10min；⑤二抗孵育：去掉洗涤液，1：2000稀释HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；⑥洗涤：洗涤液洗涤3次，每次10min；⑦显色：去掉洗涤液，加入新配制好的DAB显色液，避光条件下显色，显色5min-30min；⑧显色终止：显色适当时，倒掉显色液，加入ddH2O终止显色，ddH2O洗3次，每次10min；⑨拍照保存结果。3结果3.1BCA蛋白浓度测定试剂盒测定抗原蛋白含量BCA试剂盒测得50kDaHPSE蛋白浓度的相关数据如下表：表1BCA试剂盒测得50kDaHPSE蛋白浓度的相关数据Table.1Determiantionofconcentrationof50kDaHPSEassayedbyBCAkitBSA浓度00.050.10.20.40.60.81.0样品（稀释5倍）（μg/μl）OD5700.1040.1280.1670.2330.3550.4490.5630.760.27442 广东药学院硕士研究生学位论文用Excel处理数据，标准蛋白浓度为x轴、OD570为y轴做标准曲线，利用标准曲线计算出50kDaHPSE蛋白的浓度。所以HPSE50kDa抗原的含量为（0.274-0.0998）÷0.6225×5≈1.40μg/μl=1.40mg/mlBSA标准曲线0.8y=0.6225x+0.09982R=0.99110.70.60.50.4OD5700.30.20.1000.20.40.60.811.2BSA浓度（μg/μl）图12BSA标准曲线图Fig.12StandardcurveofBSA3.2抗原抗体工作浓度的确定表2为抗原工作浓度确定的相关数据。表2抗原工作浓度确定相关数据Table.2Determiantionofworkingconcentrationforantigens抗OD450原11.252.551020血清1:1000（+）0.9731.6911.631.681.6941.6321:2000（+）0.8721.6381.5841.6281.681.6581:4000（+）0.6141.5991.571.6171.6691.6421:8000（+）0.3821.5741.4731.5581.5771.5471:16000（+）0.2471.2951.3381.4491.5271.4461:32000（+）0.1310.9291.1531.2491.3141.2941:64000（+）0.0820.5390.9340.9851.0511.0851:128000（+）0.0490.3090.6410.7020.7530.7451:256000（+）0.0230.1670.4390.4440.5160.4861:1000（-）0.0160.0290.0140.090.0120.021空白0.020.0180.0130.090.0210.01243 广东药学院硕士研究生学位论文由于当抗原浓度为1.25、2.5、5、10、20μg/ml时，在1:8000之前是平台，所以用1:8000-1:256000之间的6个数据做曲线，1μg/ml用1:1000-1:256000之间的数据做曲线。Excel得出线性关系结果如下表所示：表3抗原浓度确定Table.3Determiantionofconcentrationforantigens22抗原浓度（μg/ml）R值抗原浓度（μg/ml）R值10.937650.98241.250.9806100.97052.50.9877200.9633从结果可见，当HPSE50kDa抗原的工作浓度为2.5μg/μl时线性最好，所以选择2.5μg/μl作为间接ELISA的抗原工作浓度。3.3免疫小鼠血清效价测定BALB/c小鼠第二次免疫后的第7天，尾静脉取血测定血清效价，测得数据如表4所示，并利用Excel比较哪只小鼠免疫的效果更好，更适合用来做细胞融合。表44只BALB/c小鼠血清效价测定Table.4Determinationofseratiterof4BALB/cmiceOD450血清1:10001:20001：40001:80001:160001:32000阴性空白编号1号0.78950.5110.4240.3260.19850.1020.030.0332号0.72350.56950.36250.34450.2250.1550.02350.02853号0.63150.4450.2960.23850.15550.1020.02350.02154号0.7060.4030.2920.23250.17950.10.0210.01844 广东药学院硕士研究生学位论文免疫BABL/c小鼠血清效价比较0.90.80.71号0.62号0.53号0.44号0.3阴性0.2空白血清效价（OD450）0.101:10001:20001:40001:80001:160001:32000血清稀释比例图13免疫BALB/c小鼠血清效价比较Fig13ComparisonofseratitresofimmunizedBALB/cmice4只小鼠的血清效价均达到1:32000，从柱形图上可以看出1、2号小鼠血清效价会高于其它两只，本次实验选择1号鼠加强免疫，进行融合实验。45 广东药学院硕士研究生学位论文3.4细胞融合后生长状况ABCD图14细胞融合后生长情况Fig.14CellsafterfusionA.融合后1天B.融合3天C融合后5天D.融合后7天A.1Dayafterfusion;B.3Daysafterfusion;C.5daysafterfusion;D.7daysafterfusion3.5杂交瘤数据统计融合后一星期统计融合率，两星期后ELISA检测有杂交瘤孔的培养基上清，此次检测所用抗原50kDaHPSE为所得数据如表5.表5杂交瘤相关数据统计Table.5Relateddataforhybridoma板号12345杂交瘤孔数3131292025阳性杂交瘤孔数01131总孔数9696969696融合率32.29%32.29%30.20%20.83%26.04%平均融合率（31+31+29+20+25）/（96×5）＝136/480＝28.33%阳性率（0+1+1+3+1）/(31+31+29+20+25)=3.6%46 广东药学院硕士研究生学位论文融合率=有杂交瘤孔数/总孔数×100%平均融合率=（X1＋X2＋…＋Xn）/n×100%阳性率=总阳性孔数/总的杂交瘤数×100%通过计算得出本次融合的平均融合率为28.33%，阳性率为3.6%3.6阳性筛选结果选取检测上清中OD值最高的两株进行亚克隆，4D12阳性亚克隆后用3种抗原进行检测，阳性率未达到100%，选取培养上清ELISA检测后OD450数值最高的E8再次克隆，第二次克隆后检测培养上清，用50kDaHPSE以及65kDaHPSE检测的阳性率均为100%，选取强阳性孔的细胞进行扩大培养、冻存。3F5阳性亚克隆后用3种抗原进行检测，阳性率未达到100%，选取培养上清ELISA检测后OD450数值最高的D10再次克隆，第二次克隆后检测培养上清，用50kDaHPSE、65kDaHPSE以及多肽检测的阳性率均为100%，选取强阳性孔细胞扩大培养、冻存。表6阳性筛选结果Table.6Resultsofpositivecolons阳抗性体4D12-14D12-23F5-13F5-2率抗原50kDa67%100%57%100%65kDa78%100%81%100%多肽0063%100%47 广东药学院硕士研究生学位论文3.7腹水效价测定表7抗体腹水效价测定Table.7Determiantionoftitersofascites编号OD4504D123F5效价1:10001.1290.9571:20000.940.8371:40000.9710.751:80000.8310.6681:160000.7370.5281:320000.6170.4241:640000.4820.3011:1280000.3590.2185阴性0.0430.0315空白0.0350.034554D12、3F5的腹水效价均大于1:1.28×10。3.8单克隆抗体小鼠抗体亚类鉴定测定筛选得到的两株可以分泌抗HPSE的单克隆抗体的细胞株所分泌的抗体的亚类，为纯化腹水中的单克隆抗体提供依据。4D12和3F5均为IgM，可以采取纯化IgM的方法对这两种抗体进行纯化。3.9纯化抗体浓度BCA试剂盒测试测纯化好的抗体的含量，BSA标准曲线如表8。表8BSA标准曲线的数据Table.8DataforBSAassayedbyBCAkitBSA浓度00.10.20.40.60.81.0（μg/ml）OD5700.1160.2920.4780.8321.0911.3231.55648 广东药学院硕士研究生学位论文2利用Excel算得BSA标准曲线公式为Y=1.4426x+0.1737，R值为0.9902。则可利用此公式计算纯化抗原的含量，结果如表9所示。表9纯化抗体的浓度Table.9Concentrationofthepurifiedantibodies浓度平均浓度编号稀释倍数OD570（μg/ml）（μg/ml）50.358638．84D12641.152.50.545643.550.273344.23F5345.452.50.371346.73.10抗体亲和常数的测定4D12亲和常数测定曲线2.521.51.25μg/mlOD45012.5μg/ml0.55.0μg/ml0051015202530-9抗体浓度（×10,mol/L）图15-14D12亲和常数测定Fig.15-1Determinationofaffinityconstantsof4D1249 广东药学院硕士研究生学位论文3F5亲和常数测定曲线21.81.61.41.25μg/ml1.212.5μg/mlOD4500.85.0μg/ml0.60.40.200.0050.00100.00150.00-9抗体浓度（×10，mol/L）图15-23F5亲和常数测定Fig.15-2Determinationofaffinityconstantsof3F59-1则根据公式计算得到，4D12的亲和常数为2.71×10M；3F5的亲和常数为6.67×8-110M。3.11WesternBlot检测抗体特异性结果WesternBlot检测抗体特异性结果见图16，第二个膜用氨基黑10B染色脱色后可见目的条带，说明电转移成功，可以用于下一步实验。每个转移膜第1、2条分别为50kDaHPSE以及人全长HPSE。第3、4个纸条分别为4D12和3F5抗原抗体反应的显色结果，说明抗HPSE单克隆抗体4D12和3F5都能与人全长HPSE、50kDaHPSE抗原特异性结合。50 广东药学院硕士研究生学位论文123456Marker170kDa130kDa95kDa72kDa43kDa26kDa图164D12和3F5westernblot结果Table16TheresultsofWesternblotof4D12and3F51.标准蛋白；2.转膜后氨基黑10B染色；3.4D12；4.3F5；5.空白；6.阴性对照1.Standardprotein;2.Stainingbyaminoblack10Baftertransblotting;3.4D12;4.3F5;5.Blank;6.Negativecontrol4讨论（1）本研究成功筛选出两株单克隆抗体杂交瘤细胞，其中4D12用50kDaHPSE、人全长HPSE以及多肽作为抗原检测时，多肽组未呈现阳性，说明这一株抗体可以和50kDaHPSE以及人全长HPSE其他抗原表位结合；3F5与50kDaHPSE、人全长HPSE以及多肽反应时均呈现阳性，表明此株抗HPSE的单克隆抗体与HPSE的肝素结合位点结合，可能成为抑制肿瘤转移的中和抗体。两次克隆后，100%阳性里面选取OD450最高的建株并将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，以此获得大量含有抗HPSE单克隆抗体的腹水。两株单克隆抗体的亲和力常数分别为9-18-152.71×10M、6.67×10M，腹水效价均高于1：1.28×10，可用于进一步研究。经过优球蛋白法纯化后可以得到纯的抗体，westernblot检测抗体的特异性，确定抗体的特异性强后，即可用于进一步的实验研究。（2）将来可用人全长HPSE免疫小鼠，用50kDaHPSE、HPSE其它活性位点多肽、活性中心多肽、C-端多肽进行筛选检测，制备出更多抗HPSE不同功能序列的单克隆抗体杂交瘤细胞株，进一步研究HPSE不同区域的功能、在肿瘤转移、炎症中的作用机制，还可研制检测HPSE的诊断试剂，为诊断肿瘤转移及预后51 广东药学院硕士研究生学位论文提供依据。深入研究中和HPSE的活性抑制肿瘤转移的情况，为开发治疗肿瘤转移的抗体药物打下基础。（3）可以将制备出来的特异性抗HPSE单克隆抗体作用于不同转移潜能的细胞株，研究肿瘤细胞中的HPSE、MMPs的转录、蛋白表达水平、酶活性、细胞侵袭转移能力的变化。探索HPSE与MMPs之间的相互调控关系，为HPSE与MMPs的调控机制提供依据，为肿瘤转移的机理以及药物开发与治疗提供一定参考依据。52 广东药学院硕士研究生学位论文结论本研究通过PCR克隆到人全长HPSE基因，该基因片段和pET28a(+)质粒同时进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切，T4DNA连接酶将HPSE和pET28a(+)质粒连接成重组质粒。重组质粒转入到E.coliDH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，PCR以及NcoⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定重组质粒，阳性质粒测序，测序正确的重组质粒转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆培养，IPTG诱导，SDS-PAGE检测蛋白诱导情况，结果成功构建了E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)原核表达系统。E.coliBL21(DE3，pET28a(+)-HPSE)进行扩大培养以及诱导，超声裂解后鉴定发现HPSE蛋白以包涵体的形式表达，不同组分的包涵体洗涤缓冲液洗涤包涵体后，包涵体裂解液裂解包涵体，HisTrapTMcrude柱纯化HPSE蛋白，最后得到高纯度的人全长HPSE蛋白。50kDa的HPSE蛋白免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤技术将SP2/0与免疫B淋巴细胞融合，间接ELISA检测抗体分泌情况，将阳性克隆进行多次筛选以及亚克隆，成功5的筛选出两株特异性较好HPSE的单克隆抗体，4D12、3F5效价均大于1.28×10，其9-18-1亲和力常数分别为2.71×10M、6.67×10M，4D12与50kDaHPSE、人全长HPSE158162反应，3F5与50kDaHPSE、人全长HPSE以及包含与肝素结合的HPSELys-Asp(50kDaN端)多肽反应。Westernblot检测发现制备的抗原与抗体能够特异性的结合。将来可研究中和HPSE的活性、抑制肿瘤转移的情况，为开发治疗肿瘤转移的中和抗体药物打下基础。目前，抗HPSE中和单克隆抗体的研究在国内还未见报道。53 广东药学院硕士研究生学位论文参考文献：[1]DenizUcar,ChristopherRCogle,JamesRZucali,etal.Aldehydedehydrogenaseactivityasafunctionalmarkerforlungcancer[J].ChemBiolInteract,2009,178(1-3):48–55.[2]JINQIANGZHANG,GANGLIU,YUHONGMENG,etal.MAG-2promotesinvasion,mobilityandadherencecapabilityoflungcancercellsbyMMP-2,CD44andintracellularcalciuminvitro[J].OncolRep，2009,21(3):697-706.[3]Chang-LiWang,Bing-ShengSun,YongTang,etal.CCR1knockDaownsuppresseshumannon-smallcelllungcancercellinvasion[J].JCancerResClinOncol,2008,135(5):695-701.[4]QingZhang,KeikoFurukawa,Ho-HsiangChen,etal.MetastaticPotentialofMouseLewisLungCancerCellsIsRegulatedviaGangliosideGM1byModulatingtheMatrixMetalloprotease-9LocalizationinLipidRafts[J].JBiolChem,2006,281(26):18145-18155.[5]HeymachJV,Paz-AresL,DeBraudF,etal.RandomizedphaseIIstudyofvandetanibaloneorwithpaclitaxelandcarboplatinasfirst-linetreatmentforadvancednon-small-celllungcancer[J].JClinOncol,2008,26(33):5407-5415.[6]TakemuraA,GemmaA,ShibuyaM,etal.Gemcitabineresistanceinahighlymetastaticsubpopulationofapulmonaryadenocarcinomacelllineresistanttogefitinib[J].IntJOncol,2007,31(6):1325-1332.[7]RinaldiM,CauchiC,GridelliC.FirstlinechemotherapyinadvancedormetastaticNSCLC[J].AnnOncol,2006,17Suppl5:v64-v67.[8]瞿小婷.乙酰肝素酶分子和细胞模型及其结构与功能关系的研究[D].南京：中国药科大学生物技术中心，2004.[9]李九州,霍钢,郑履平,等.MMP-9、HPSE及CD34在侵袭性垂体腺瘤中表达的研究[J].中国神经精神疾病杂志，2007,33(7):404-407.[10]李燕杰,彭清忠.乙酰肝素酶的结构、功能及调控[J].生物技术通讯，2003,14（2）:141-144.54 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广东药学院硕士研究生学位论文致谢光阴荏苒，硕士研究生学习即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。在完成硕士论文的过程中，受到各位亲朋师友的关怀和帮助，在这里郑重的感谢各位。首先向我的导师田素娟教授致以崇高的敬意以及深深的谢意，导师在学习和生活方面都给予我很大的帮助和关心。田老师为人谦和，平易近人。在论文选题、收集资料和写作阶段，田老师都倾注了大量的心血。在实验过程中，每当有疑问，田老师总会不厌其烦地指导我。在论文写作完善过程中，由于被抽中盲审，时间紧迫，田老师曾帮我修改论文到凌晨，修改论文的过程中，田老师字字把关，提出许多中肯的意见。她严谨的治学之风以及对事业孜孜不倦的追求将激励我一生，她对我的关心和教诲我更将永远铭记。感谢董斌、林月霞等各位老师，他们知识渊博和实践经验丰富，在实验过程中对我总是不吝于指教，使我少走很多弯路。感谢广东药学院各位任课老师对我的教育与培养。感谢广东药学院生命科学与生物制药学院提供舒适的实验坏境。感谢师姐带我熟悉实验室，教会我许多实验知识。感谢各位师弟师妹，有了你们，实验室变得更加温馨，研究生生活也变得更加多姿多彩。感谢刘昆云、胡广蕊、朱磊、区裕升、陈敬生、贾欢欢、刘妍、黄思玉等同窗好友在学习、实验、生活中给予的帮助和关怀。感谢我的爸爸、妈妈、姐姐和弟弟，感谢我的亲人，是你们的支持和帮助让我顺利完成研究生生涯。感谢我的挚友曾胜燕、王朝辉、陈小凤，感谢你们在我迷惘时给我加油打气，感谢你们在我烦闷时给我开导，感谢你们在我找工作的过程中给予的无私关怀和帮助。感谢所有给予我帮助和善意的人，你们的帮助和善意是我前进的最大动力。59