鸭tlr5分子的原核表达及其单克隆抗体的制备

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2、Ｊ？．义，，－申请学位级别：硕壬学科专业名称：预防兽医学－／；爭，－：论义提巧日期１５５２０１５年５月之．：：２０年月论文答辩日期：為梦■学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２（Ｕ５年６月：／，＇＇■答辩委员会主席：了护ｉ、、妓邏耐年６貞灸苗扭．每亡带；一？ｖ．石奇冥产讀琴一齊覆．：＇．＼１．；渝金和：国無／Ｊ＾為爲．成杨美蠢鸭ＴＬＲ５分子的原核表达及其单克隆抗体的制备１鸭化Ｒ５分子的原核表达及其单克隆抗体的制备研究生：杨美蠢导师；焦新安教授潘志明教授中文摘要一Ｔｏ－ｋｒｓｌｌ样受体（Ｔｏｌｌｌｉｅｒｅｃｅｔｏ

3、ＴＬＲｓ）是类跨膜蛋白家族，通过识别病原相关分子ｐ，ｈｏ－模式（ＰａｔｅｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒａｔｅｒｎｓＰＡＭＰｓ）诱导先天性免疫应答。ＴＬＲｓ被认为ｇｐ，是最有特点的先天性受体。，在宿主抗感染免疫中发挥重要作用不同的ＴＬ艮Ｓ识别特定的分子标志并且启动先天性免疫应答，如ＴＬＲ２和ＴＬＲ３复合物或ＴＬＲ２和ＴＬＲ６复合物识别脂肤或脂蛋白，ＴＬＲ３识别病毒的双链ＲＮＡ，ＴＬＲ４识别脂多糖，ＴＬＲ５识别鞭毛蛋白，８Ｇ－ＤＮＡＴＬＲ７和ＴＬＲ识别单链ＲＮＡ，Ｗ及ＴＬＲ９识别细菌的Ｃｐ。５一ＴＬＲ是类限制性表达受体、／巨帷细胞、树突状细胞，主

4、要表这在上皮细胞单核（ＤＣ）等细胞的表面。鞭毛蛋白是ＴＬＲ５的特异性配体，ＴＬＲ５识别鞭毛蛋白后，启动Ｄ８８ＮＦ－ｋＢ）Ｍ。ｙ依赖的信号通路，激活转录因子（诱导前炎性细胞因子的产生目前，针对先天性免疫应答的研究主要Ｗ人或小鼠为模型，而对于家禽的研究则较为少见，主要是由于缺乏与家禽相关的生物试剂材料。因此，本研究构建表达了鸭ＴＬＲ５分子的胞外区（ＥＣＤ）片段，并制备了针对ＴＬＲ５（ＥＣＤ）的单克隆抗体，Ｗ期为家禽先天性免疫应答研究提供材料。Ｊ本研究ｌＴＬＲ５ｃＤＮＡ为ＤＮＡ，设计合成引，＾＾实验室前期制备的鸭模板物利用高保真聚合酶扩增鸭ＴＬＲ５巧ＣＤ）基因片段，片

5、段大小为１６０８ｂｐ。将扩増的目的基因片段连接－ＭＤ２０－Ｔ克隆载体于Ｐ，经筛选鉴定正确后，将目的基因分别连接于原核表达载体ｐＣｏｌｄ１－ＧＥＸ－６－－和ｐｐｌ，经筛选鉴定正确后，分别将构建的原核重组质粒ｐＣｏｌｄＩＴＬＲ５和－－－－－ＧＥＸ６ｐｌＴＬＲ５转化宿主大肠杆苗ＢＬ２１，从而构建出重组菌ｐＣｏｌｄ１ＴＬ民５／ＢＬ２１和ｐ－ＧＥＸ６－ｌ－ｐｐＴＬＲ５／ＢＬ２１〇－－Ｃｏ－－－将重组菌ｌｄ１ＴＬＲ５／ＢＬ２１和ＧＥＸ６ｌＴＬＲ５／ＢＬ２１分别接种于含有Ａｍ的ＬＢｐｐｐｐ液体培养基中，加入ＩＰＴＧ诱导重组融合蛋白的表达，收集菌体，超声波裂解茵体，离

6、也－ＰＡＧＥ凝胶电泳－后分别收集上清和沉淀进行ＳＤＳ，根据电泳结果判定，重组融合蛋白ｒＨｉｓＴＬＲ５和ｒＧｓｔ－ＴＬＲ５均表达在包涵体中。ｒＨ－－Ｗ重组融合蛋白ｉｓＴＬＲ５为免疫原免疫６８周龄的雌性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，应用Ｂ淋巴扬州大学硕±学位论文Ｉ细胞杂交瘤技术，通过间接ＥＵＳＡ方法和２次亚克隆筛选，获得６株能够稳定的分泌抗ＴＬＲ５单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ｃ１０、他５、纯９、５Ｂ１１、５巧和瓜７。对获得的６株细胞株分别进行培养上清效价、腹水效价和抗体亚类测定。结果显示，４６１Ｃ１０、４Ｂ５、５Ｂ９和６Ｄ７的培养上清效价均在１０Ｗ上；纯１１株

7、腹水效价低于１０，其余７均在１０。抗体亚类鉴定显示，５巧株为ＩｇＧｌ，其余５株均为ＩｇＭ。对收集的腹水单克隆抗体进行透析处理，然后用ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱纯化－ＰＡＧＥ凝胶电６，收集纯化后抗体进行ＳＤＳ泳，电泳显示株抗体的纯化效果整体较Ｃ－－好。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ结果显示，每株抗体均与经诱导的重組菌ｐｏｌｄ１ＴＬＲ５／ＢＬ２１和一Ｇ