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1、ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定作者：曹伟,郝志勇郗雪艳孔燕马驰崔莲仙何维【关键词】ULBP4;,NKG2D;,IFN ExpressionandbiologicalfunctionofULBP4inRosettagamiTMB(DE3)andmAbpreparation [Abstract]AIM:ToexpresshumanULBP4inRosettagamiTMB(DE3)andtopreparemonoclonalantibodyagainstULBP4fo
2、rtheresearchofγδTcellsrecognitionmechanism.METHODS:DNAfragmentsofULBP4HO8910RNAbyreversetranscriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).Thefragmentsencodingtheformer225aminoacidsofULBP4anufactory’sprotocolandrenaturedinbagfilter.It’sfunctionaleffectonNKcell
3、sents.ProkaryoticexpressedhumanULBP4onoclonalantibodiesbymeansoftheBlymphocytehybridomatechnique.RESULTS:ULBP4rebinantproteincanstimulateNKcellstosecreteIFNγ.ThroughPEGfusionandscreeningbylimiteddilution,acellssecretingantiULBP4antibodies.CONCLUSION:The
4、fusionproteinetime,theantiULBP4mAbsprovideaplatformforfurtherresearch. [KeyiTMB(DE3)E.coli;Expression;Biologicalfunction;monoclonalantibody ［摘要］目的:在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体（mAb）,为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物,用RTPCR方法从HO8
5、910细胞中扩增得到ULBP4片段,构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段),在RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中,经纯化透析复性后,分析其对NK细胞IFNγ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化培养、荧光免疫检测和流式细胞术以及B(DE3)大肠杆菌;表达;生物学功能;单克隆抗体 NKG2D是一种激活性的C型凝集
6、素受体,由同源二聚体构成,表达于多种淋巴细胞的表面。近几年,发现了一种新的NKG2D的配体家族UL16bindingproteins（ULBPs又称为RAET1分子）[1,2],其中,ULBP13为糖基磷脂酰肌醇连接的膜蛋白,而ULBP4和RAET1G则为含跨膜区域和胞内区域的膜蛋白。它们在正常组织细胞表面不表达或表达量很低,但病毒感染和细胞恶性转化后能明显增强其表达,暗示了它们在抗感染免疫和肿瘤免疫中潜在的作用。序列分析提示其与MICA较为相似,且都属于延伸的MHCI类分子家族,但只含α1和α2功能
7、域且不能呈递小肽。鉴于其序列上与MICA的相似性,提示其可能也为γδ1T细胞群的抗原之一[3]。事实上,已有证据表明其中的一个分子ULBP3可以被慢性B型淋巴细胞性白血病患者外周血的γδ1T细胞群所识别[4]。为了进一步加深对γδT细胞识别机制的认识,我们在原核表达系统中表达并纯化了ULBPs家族的另外一个成员ULBP4,同时制备其单克隆抗体（mAb）,为今后的研究工作奠定实验基础。 1材料和方法 1.1材料克隆载体pGEMTEasyVectorSystem购自Promega公司,原核表达质粒pE
8、T22b(+)和宿主菌RosettagamiTMB(DE3)E.coli均购自Novagen公司,DH5α菌为本室保存。HO8910人浆液性卵巢腺癌细胞株、803人低分化胃腺癌细胞系以及CHO中国仓鼠肾细胞系也为本室保存,均以含100mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液进行贴壁培养。而HepG2人肝癌细胞系则以含100mL/L小牛血清的MEMNEAA完全培养液进行贴壁培养（HO8910、803、HepG2均为ULBP4mRNA阳性的细胞株）。NK
