ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定

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1、ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定作者：曹伟,郝志勇梆雪艳孔燕马驰崔莲仙何维【关键词】ULBP4；,NKG2D；,IFNExpressionandbiologicalfunctionofULBP4inRosettagamiTMB(DE3)andmAbpreparation[Abstract]AIM：ToexpresshumanULBP4inRosettagamiTMB(DE3)andtopreparemonoclonalantibodyagainstULBP4fortheresearchofY8Tcel

2、lsrecognitionmeAfragmentsofULBP4wlORNAbyreversetranechainreaction(RTPcodingtheformer225ereclonedintoHistaessionvectorpET22bonULBP4(225a)protEclusionbodyandpurirdingtomanufactoryuredinbagfilter.Itchanism.METHODS：DNerederivedfromH089scriptasepolymerasCR).Thefragmentsenam

3、inoacidsofULBP4wgfusionprotEinexpr(+).TheCHistagfusiInwasexpressedininfiedstepbystepaccosprotocolandrenatsfunctionoleffectonNKcel1swasevaluatedbyNKG2DbindingassayandIFNYsecretionexperiments.ProkaryoticexpressedhumanULBP4wasusedasanantigentopreparemonoclonalantibodiesby

4、meansoftheBlymphocytehybridomatechnique・RESULTS:ULBP4recombinantproteincanstimulateNKcellstosecretelFNY・ThroughPEGfusionandscreeningbylimiteddfourstrainsofhybrgantiULBP4antibodiusionproteinwasexpandfunctiona1.AtthLBP4mAbswerepreparhofthemprovideapladilution,weobtaineid

5、omacellssecretines.CONCLUSION：Thefressedsuccessfullyesametime,theantiUedsuccessfully.Bottfomiforfurtherresearch.[Keywords]ULBP4；NKG2D；IFNY；RosettagamiTMB(DE3)；Expression；Biologicalfunction；monoclonalantibody[摘要]目的：在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体，为Y细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方

6、法：根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物，用RTPCR方法从H08910细胞中扩增得到ULBP4片段，构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段),在RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中，经纯化透析复性后，分析其对NK细胞IFNY细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原，免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合，依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化培养、荧光免疫检测和流式细胞术以及Westernbiot筛选和鉴定抗

7、ULBP4mAb的杂交瘤细胞株。结果：构建了pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达体系，并检测到重组蛋白的有效表达；纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFNy细胞因子的分泌。此外，还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4mAb的杂交瘤细胞株。结论：成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4,为Y5T细胞的识别机制研究建立抗原制备平台，同时所制备的抗人ULBP4niAb,为后续研究奠定了基础。［关键词］ULBP4；NKG2D；IFNy；RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌;表达；生物学功能；单克隆抗体N

8、KG2D是一种激活性的C型凝集素受体，由同源二聚体构成，表达于多种淋巴细胞的表面。近几年，发现了一种新的NKG2D的配体家族ULI6bindingproteins[l,2],其中，ULBP13为糖基磷脂酰肌醇连接的膜蛋白,而ULBP4