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1、ULBP4原核表达、生物学功能鉴定及其单克隆抗体的制备和初步鉴定论文.freeliTMB(DE3)andmAbpreparationAbstractAIM:ToexpresshumanULBP4inRosettagamiTMB(DE3)andtopreparemonoclonalantibodyagainstULBP4fortheresearchofγδTcellsrecognitionmechanism.METHODS:DNAfragmentsofULBP4HO8910RNAbyreverse
2、transcriptasepolymerasechainreaction(RTPCR).Thefragmentsencodingtheformer225aminoacidsofULBP4anufactory’sprotocolandrenaturedinbagfilter.It’sfunctionaleffectonNKcellsents.ProkaryoticexpressedhumanULBP4onoclonalantibodiesbymeansoftheBlymphocytehybrido
3、matechnique.RESULTS:ULBP4rebinantproteincanstimulateNKcellstosecreteIFNγ.ThroughPEGfusionandscreeningbylimiteddilution,acellssecretingantiULBP4antibodies.CONCLUSION:Thefusionproteinetime,theantiULBP4mAbsprovideaplatformforfurtherresearch.KeyiTMB(DE3)
4、E.coli;Expression;Biologicalfunction;monoclonalantibody［摘要］目的:在大肠杆菌中表达ULBP4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体（mAb）,为γδT细胞对ULBP4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ULBP4的基因序列设计相应的引物,用RTPCR方法从HO8910细胞中扩增得到ULBP4片段,构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ULBP4(前225aa胞外段),在RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达
5、且主要位于包含体中,经纯化透析复性后,分析其对NK细胞IFNγ细胞因子分泌的影响。以ULBP4为抗原,.freelAb的杂交瘤细胞株。结果:构建了pET22b(+)/ULBP4(225aa)原核表达体系,并检测到重组蛋白的有效表达;纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFNγ细胞因子的分泌。此外,还获得了4株可稳定分泌抗人ULBP4mAb的杂交瘤细胞株。结论:成功地构建并表达了具有生物活性的ULBP4,为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台,同时所制备的抗人ULBP4mAb,为后续
6、研究奠定了基础。［关键词］ULBP4;NKG2D;IFNγ;RosettagamiTMB(DE3)大肠杆菌;表达;生物学功能;单克隆抗体NKG2D是一种激活性的C型凝集素受体,由同源二聚体构成,表达于多种淋巴细胞的表面。近几年,发现了一种新的NKG2D的配体家族UL16bindingproteins（ULBPs又称为RAET1分子）1,2,其中,ULBP13为糖基磷脂酰肌醇连接的膜蛋白,而ULBP4和RAET1G则为含跨膜区域和胞内区域的膜蛋白。它们在正常组织细胞表面不表达或表达量很低,但病毒感
7、染和细胞恶性转化后能明显增强其表达,暗示了它们在抗感染免疫和肿瘤免疫中潜在的作用。序列分析提示其与MICA较为相似,且都属于延伸的MHCI类分子家族,但只含α1和α2功能域且不能呈递小肽。鉴于其序列上与MICA的相似性,提示其可能也为γδ1T细胞群的抗原之一3。事实上,已有证据表明其中的一个分子ULBP3可以被慢性B型淋巴细胞性白血病患者外周血的γδ1T细胞群所识别4。为了进一步加深对γδT细胞识别机制的认识,我们在原核表达系统中表达并纯化了ULBPs家族的另外一个成员ULBP4,同时制备其单克
8、隆抗体（mAb）,为今后的研究工作奠定实验基础。1材料和方法1.1材料克隆载体pGEMTEasyVectorSystem购自Promega公司,原核表达质粒pET22b(+)和宿主菌RosettagamiTMB(DE3)E.coli均购自Novagen公司,DH5α菌为本室保存。HO8910人浆液性卵巢腺癌细胞株、803人低分化胃腺癌细胞系以及CHO中国仓鼠肾细胞系也为本室保存,均以含100mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液进行贴壁培养。而HepG2人肝癌细胞系则以含100mL/L小牛
