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1、人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备作者：陈章权*,黄震,梁晓东,陆田田,何天文【摘要】 目的:原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。方法:用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导重组蛋白的表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并以ELISA、Westernblot及免疫组织化学法检测抗体。结果:在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白,用其免疫小鼠,获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体,免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的
2、天然CD1d分子。结论:成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体,为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。【关键词】CD1d基因表达抗体制备 CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子,分为CD1-I和CD1-II两组,前者包括CD1a、CD1b、CD1c和CD1e等4个分子,后者只有CD1d分子［1］。CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞外区组成,胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成,11它主要提呈糖脂抗原,在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1,2］。在CD1d基因
3、克隆过程中,我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体,跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此,我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测,但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在,在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上,我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达,并制备了其鼠源性抗体。 1材料和方法 1.1材料大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。克隆载体pGEM-T、反转录试剂盒购自Promega公司;表达载体pET28和N
4、i2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。RNA提取试剂、PCR产物回收、质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品,常规试剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。 1.2方法11 1.2.1CD1d分子胞外区编码基因的克隆取手术切除的新鲜人小肠组织抽提RNA,经鉴定RNA无降解后进行反转录,操作按反转录试剂盒说明进行。以合成的cDNA为模板进行hCD1d胞
5、外区编码基因扩增,引物如下:1:5′-CCATGGTCCCGCAAAGGCTTTTCCC-3′(划线部分为NcoI酶切位点),引物2:5′-CTCGAGCCAGTAGAGGACGATGTCCTG-3′(划线部分为XhoI酶切位点)。PCR条件为94℃变性30s,55℃退火50s,72℃延伸40s,32个循环后,于72℃延伸7min。PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板,于37℃培养过夜,挑取白色菌落进行培养,提取重组质粒,以EcoRI进行酶切鉴定,
6、将质粒命名为pGEM-T/hCD1d。阳性克隆进行DNA测序,对所得序列用BLAST软件进行序列同源性分析。 1.2.2原核表达载体的构建用NcoI和XhoI分别对pGEM-T/hCD1d质粒和原核表达载体pET28进行双酶切,凝胶电泳后,纯化回收切下的hCD1d基因片段和pET28片段,并用连接酶将2个片段16℃连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,然后将菌液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板,筛选阳性表达克隆,进一步用PCR和测序进行鉴定,命名为pET28/hCD1d。11 1.2.3目的蛋白的诱导表达重组质粒pET28/hCD1d转化感受态菌大肠杆菌BL21(DE3
7、),37℃培养过夜。挑取菌落经PCR筛选及测序鉴定正确后,接种于LB液体培养基（含50mg/L卡那霉素）,37℃培养过夜后,按1∶100比例接种到LB液体培养基中,待菌液的A600值达0.5~0.6时加入IPTG(终浓度为1mmol/L),37℃诱导表达5h,离心收集菌体,超声破碎后,分别取细菌裂解上清、沉淀部分及总菌蛋白行SDS-PAGE分析,取未经诱导的重组菌为对照。 1.2.4蛋白复性与纯化离心收集5
