唾液酸黏附素胞外区结构域的原核表达及其多克隆抗体制备

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1、河南农业大学硕士学位论文唾液酸黏附素胞外区结构域的原核表达及其多克隆抗体制备姓名：张继希申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：夏平安；崔保安201206河南农业大学2012届预防兽医学硕士学位论文摘要猪繁殖与呼吸综合征病(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，P赇S)是是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PSRSV)引起的以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道症状为主要特征的传染

2、病，在猪体内主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcinealveolarmacrophages，PAM)。与PR骼V感染相关的受体主要有唾液酸黏附素(Sialoadhesin，Sn)、CDl63分子受体和硫酸乙酰肝素OIeparinsuIphate，as)。其中Sn受体可以黏附PRRSV并介导PRRSV的内吞作用。本文通过原核表达Sn胞外区结构域重组蛋自及制备多克隆抗体，为研究结合PRRSV的SIl受体胞外区结构域的功能作用打下坚实基础。本试验从健康猪肺收集咖细胞，提取P枷细胞总RN^，分析sn受体基因胞外区结构域，发现

3、其胞外区共有15个结构域，将其分成8段，用RT_P啄方法扩增出8个结构域的基因片段，大小分别为267bp、504bp、518bp、556bp、510bp、478bp、481bp、535bp，将这八个基因片段分别亚克隆到PU蕊一T载体中，进行序列测定。利用DNAStar软件分析了八个结构域的拼接序列与6enbank上发表的Sn受体胞外区核苷酸序列的同源性，结果为9【9．2％一99．6多《。根据唾液酸黏附素受体基因序列，设计了八对5’端带有点coRI酶切位点，3’端带有Sal．，酶切位点的特异表达引物。根据设计的引物扩

4、增出八段基因，大小分别为267bp、504bp、518酾、5；56bp、510bp、478bp、481bp、535bp。将所扩增出的基因片段分别亚克隆到原核表达载体pET32a中，构建了重组表达质粒P盯一Snl，PET-Sn2，PEIr_sn3，PET—Sn4，PET一瞒n5，雎卜Sn瓯PET-Sn7，PE卜Sn8。其中将PET-Snl，PET-Sn2,PET—Sn3在IPTG的诱导下成功表达，获得了分子量大小分别约为28KDa、42ZDa、41如a的重组蛋白rSnl、rSn2、rSn3、与预期的蛋白分子量相符；通

5、过优化表达条件，大量表达重组蛋白，用尿素法对表达的蛋白进行纯化与复性。纯化重组蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，目的蛋白的纯度分别达到85％、85％、87％。用rSnl、rsn2、rSn3纯化蛋白分别免疫小鼠，制各抗重组蛋白rSnl、rsIl2、rSn3的多克隆抗体，经间接ELISA检测，效价均达到1：12800。将特异性多抗做免疫印迹，结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合，表明表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。关键词：唾液酸黏附素；结构域；PRRSV；PAM细胞；河南农业大学2012届预防兽医学硕士学位

6、论文TheprokaryoticexpressionextracellularstructuredomainofsialoadhesinandpolycionaiantibodyproductionSupervisor：Prof．XiaPing-anMasterCandidate：ZhangJi-)【iABSTRACT：Theporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRsv)isoneofmainpathogensofporcinereproductivea．

7、ThetargeteellofPRRsvisporcinealveolarmacrophage(PAM)．PRRsvinfectionP．fU订cellsthedependonthreereceptors：Heparinsulfate(HS)，Sialoadhesin(Sn)andCDl63molecules．Sialoadhesincanadsorptionandmediatvirusparticleinternalization．Inthiswriting,Snextracelhlardomainstructu

8、raldomainrecombinantproteinwasexpressedthroughprokaryoticvectorandantirecombinantprotein觚tibodyWa．qdetected．ObtainedPAMcellsbyclysislungandextractiontotalRNAofPAMcells．AnalysisSnre