小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备.pdf

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1、第31卷第2期暨南大学学报(医学版)VO1．31No．22010年4月JounlalofJinanUniversity(MedicineEdition)Apr．2010小鼠附睾特异性辅脂酶的原核表达及其抗体的制备关艺青，禹艳红，黄丹，潘善培(暨南大学生命科学技术学院生殖免疫研究所，广东广州510632)[摘要]目的：利用原核表达系统重组表达小鼠附睾特异性辅脂酶(meClps)，并制备抗meClps抗体。方法：通过生物信息分析meClps蛋白结构，Oligo6设计引物，PCR法从小鼠附睾eDNA中扩增胱C全长序列并克隆到pMD19一T载体中。将含脚c序列pMD19一T载体通过PC

2、R扩增成熟肽区段序列，重组到pET-21b原核表达载体上，经菌落PCR及测序鉴定后，转化到表达菌株EcoliBL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白表达后用Trieine．SDS．PAGE和Westernblotting检测重组meClps的表达。包涵体沉淀经浓度为2mol／L尿素洗涤，Trieine．SDS．PAGE分离、染色、脱色，切下目的条带用生理盐水浸泡、磨碎与弗氏佐剂混合后免疫新西兰大白兔获取免疫血清，Westernblotting检测抗体与meClps反应。结果：在原核表达系统成功重组表达meClps，目的蛋白主要以包涵体形式存在，制备了高效价的兔抗meClps抗体。

3、结论：成功建立meClps的原核表达系统和获得兔抗meClps抗体。[关键词]附睾；辅脂酶；原核表达；抗体[中图分类号】R715．2[文献标志码】A[文章编号】1000—9965(2010)02—0105—06Prokaryoticexpressionofmouseepididymis-specificcolipaseandpreparationofitsantibodyGUANYi—qing，YUYan—hong，HUANGDan，PANShan—pei(InstituteofReproductiveImmunology，ColegeofLifeScienceandTechn

4、ology，JinanUniversity，Guangzhou510632，P．R．China)[Abstract]Ainl：Toexpressmouseepididymis—specificcolipase(meClps)inpmkaryoticsystemandpreparetheanti—meClpsantibody．Methods：ThemeClpsproteinstructurewasanalysedbyusingbioin—formation，andprimersweredesignedwithOligo6．Thefull—lengthofmeClpswasampl

5、ifiedfrommouseepididymalcDNAandclonedintopMD]9一Tvector．ThesequenceofmaturepeptidewasobtainedbyPCRfrompMD19一TvectorwithmeClps．Thentheproductwasrecombinedintothepmkaryoticexpressionvec—torpET-21b．TherecombinantplasmidwasidentifiedbyclonePCRandsequencingbefore~ansformationintocoliBL21(DE3)．Afte

6、rinducedbyIPTG，therecombinantmeClpsproteinwasexpressedandsepreatedbyTrieine—SDS—PAGE，andthenidentifiedbyWesternblotting．Theinclusionbodieswerewashedwith2mol／LureaandsepreatedbyTricine—SDS—PAGE．Afterstaininganddestaining，thegelcontainingmeClpsproteinwascut，equilibratedwithphysiologicalsalines

7、olution，rubbed，andemulsi—fledwithFreundadjuvant，thenusedasantigentoimmunizerabbitandprepareantibodies．Theanti-meClpsantibodyresponsewasidentifiedbyWesternblotting．Results：ThemeClpsproteinwassuccess-fullyexpressedinprokaryoticsystem．butmainlyininclu