德国小蠊Bla g 2的原核表达及其多克隆抗体的制备.pdf

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1、第38卷第4期河南师范大学学报(自然科学版)Z．38No．42O10年7月JournalofHenanNormalUniversity(NaturalScience)July．2010文章编号：lOOO一2367(2010)04—0136—04德国小蠊Blag2的原核表达及其多克隆抗体的制备张红绪，邢文会，刘丹丹，胡萍，杨萍。(1．河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007；2．河南教育学院人口与生命科学系，郑州450046；3．海我武生物科技有限公司，上海200233)摘要：利用RTPCR技术扩增德国小蠊Blag2基因，将其克隆进pET一41b载体．在大肠杆菌中经IPTG诱导表达

2、获得GST—Blag2蛋白，SDS—PAGE分析表达产物，得到相对分子量约74kDa的融合蛋白．通过亲和层析法纯化表达的GSTBlag2蛋白，并以此表达产物制成油SLN疫苗免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体．间接ELISA法测得抗体效价达到1：300000．Western印迹表明抗体有较高的特异性，可分别与GST-Blag2融合蛋白和德国小蠊变应原浸提液反应．Blag2在大肠杆菌中的成功表达及其多克隆抗体的制备，为德国小蠊过敏患者的诊断和治疗提供了帮助．关键词：Blag2；原核表达；多克隆抗体中图分类号：Q813．2文献标志码：A蜚蠊(cockroach)，俗称蟑螂，属于昆虫纲，节肢动物门

3、，蜚蠊目，是过敏性哮喘的主要致敏原之一，其排泄物、虫卵、尸体、蜕皮、碎屑等经吸入、接触、食人等途径进入人体，从而引起过敏性哮喘1]]．目前，全国范围内蜚蠊的分布有上升趋势，德国小蠊(Blattellagermanica)已成为室内优势种之一，其体内的主要致敏蛋白Blag2是引起哮喘的重要变应原．本研究从德国小蠊体内提取总RNA，以逆转录所得的cDNA为模板，PCR扩增获得Blag2基因片段，将该基因片段克隆到原核表达载体pET一41b中，经转化、筛选，对重组载体进行酶切鉴定和测序分析后，转化进E．coliBL21(DE3)，经IPTG诱导，成功表达了Blag2，并以此表达产物免疫新西兰

4、白兔，制备出抗Blag2的多克隆抗体．1材料与方法1．1材料德国小蠊由上海市疾病预防控制中心提供；新西兰白兔(宝山区罗泾飞达实验动物养殖场)；载体质粒pET-41b，E．coliBI21(DE3)由中科院细胞所提供．RTPCR试剂盒(TOYOBO)；A型小量DNA片段快速胶回收试剂盒(博大泰克)；限制性内切酶BamHI，XHolI，T4连接酶(TaKaRa)；HRP标记的羊抗兔IgG(Sigma)．1．2方法1．2．1德国小蠊浸提液的制备将德国小蠊禁食5h，一20。C冻存0．5h．无水乙醇浸泡1h，研磨后丙酮脱脂．用碳酸氢盐一盐水提取液浸提72h，过滤除菌后4℃保存．1．2．2重组质粒

5、的构建及阳性克隆的筛选设计特异性引物(上游引物：5’一gatcggatccgatgattggccta—aagctagt一3’；下游引物：5gatcctcgagttagacgctttctactgaacggc一3’)，引入限制性酶切位点BamHI和XHolI．通过PCR扩增Blag2基因．PCR循环条件为：94℃变性50S；55℃退火1min；72℃延伸2min，共35个循环．PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收．扩增的Blag2基因和表达载体pET一41b分别用BamHI和XHolI进行双酶切，胶回收试剂盒回收，用T4连接酶4℃连接过夜，并转化至E．coli收稿日期：20

6、10—01—10基金项目：河南省科技攻关项目(0624410030)；河南省动物重点学科资助作者简介：张红绪(1955一)，男，河南洛阳人，河南师范大学教授，主要从事哺乳类动物癌前病变分子机理的研究第4期张红绪等：德国小蠊Blag2的原核表达及其多克隆抗体的制备137BL21(DE3)感受态细胞．挑取阳性克隆扩增后提取质粒，用BamHI和XHolI进行双酶切鉴定后测序．1．2．3重组克隆在E．coliBL21(DE3)中的表达及纯化空太小挑取阳性克隆接种在含Kan+的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0．6～1．0时，加入IPTG(终浓度为lmmol／L)诱导表达，分别于诱导0

7、、1、2、3、4h时分别取样，12SDS-PAGE分析蛋白的表达，以空载体转化E．coliBL21(DE3)作为阴性对照，于诱导0、4h取样．将收集到的菌体超声破菌后，lO000r／rain离心5rain，取沉淀用2M尿素洗涤，并用8M尿素变性，经Ni亲和层析柱纯化后用于制备多抗．1．2．4免疫动物空太小初次免疫时取100肛g纯化的Blag2与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下多点注射．初次免疫2周后，进行第二次免疫，取100ptg纯化的Blag2