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《T7噬菌体衣壳蛋白P11原核表达、纯化及其单克隆抗体制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、T7噬菌体衣壳蛋白P11原核表达、纯化及其单克隆抗体制备【摘要】目的：表达、纯化T7噬菌体衣壳蛋白P11,并制备其单克隆抗体(mAb)o方法：克隆并表达T7噬菌体P11蛋白，其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠，经融合、筛选制备特异性mAbo结果：成功表达了P11蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为27000o获得了1株稳定分泌抗P11抗体的杂交瘤细胞株(2G11),其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG2b°ELISA检测，对应腹水mAb的效价为1：8.1X105oWesternblo
2、t结果显示抗PllmAb具有良好的特异性。结论：成功地制备了P11蛋白及其mAbo【关键词】T7噬菌体P11蛋白核表达单克隆抗体T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体[1],基因组为线状双链DNA,长39936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白P10A、次要头蛋白P10B、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17[2,3]。T7噬菌体作为一种常见的展示系统[4-6],因其载体容量大，插入片段稳定，洗涤条件灵活，生长周期短而被广泛使用。为进一步研究T7噬菌体尾蛋白P11蛋白结构和功能，并为建立T7噬菌体快速准确的检测方法奠定基
3、础，我们进行了原核表达、纯化P11蛋白并制备出具有良好特异性的mAbo1材料和方法1.1材料质粒pET28a（+）xT7select103bcontrol,大肠杆菌ToplO株，大肠杆菌BL21（DE3）以及Sp2/0细胞均由本室保存。限制性内切酶NdeI和BamHI均购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。NiNTAHisBindresin购自Amersham公司。HRP羊抗鼠IgG和Ig亚类（型）鉴定试剂盒Sigma公司产品。BALB/c小鼠由本研究所实验动物中心提供。1.2方法1.2.1重组原核表达载体的构建
4、以T7select103bcontrol质粒为模板，加入针对G11基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物为：5fggaattccatatgatgcgcteataegatatgaac3'（划线处为NdeI酶切位点）下游引物为：5’egggateettagegagtcagtagaccag3Z（戈U线处为BamHI酶切位点）。扩增反应的条件为：94£变性5min,然后进行30个循环：94°C30s,58°C45s,72°C60s,最后72°C延伸8mino用胶回收试剂盒纯化PCR产物，用NdeI和BamHI双酶切PCR产物和pET28a(
5、+),T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌ToplO株，抽取质粒，NdeI和BamHI双酶切鉴定并测序确认正确，成功构建重组表达载体pET28a(+)/Gilo1.2.2重组P11蛋白的表达及纯化将pET28a(+)/Gl1转化大肠杆菌BL21(DE3)O用异丙基BD硫代半乳糖昔(IPTG)分别诱导表达4、6、8h,通过SDSPAGE分析比较诱导前后结果。挑单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37匸震荡培养过夜，按1：100转接到200mL培养基中，379培养至A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L
6、,3(TC诱导表达4h。收集菌液，以8000r/min离心10min收集菌体，用缓冲液A(pH7・4、20mmol/LPB.0.5mol/LNaCl.1mmol/LPMSF)重悬细菌沉淀，经超声破碎细菌后，以12000r/min离心10mino取上清，采用DuoFlow系统(BioRad)NiNTA亲和柱层析，缓冲液B(pH7・4、20mmol/LPB.0.5mol/LNaCl>0.5mol/Limidazole)梯度洗脱。收集洗脱峰，120g/LSDSPAGE鉴定纯化效果。1.2.3动物免疫用400uL纯化的pll蛋白(1.0g/
7、L)稀释于6000PLPBS(0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl)并与等量完全弗氏佐剂混合充分乳化，多点皮下注射免疫BALB/c小鼠（50Pg/只）。1个月后，经腹腔注射加强免疫，用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原，注射剂量同前，后每隔2周分别进行第3次和第4次加强免疫。1.2.4细胞融合与抗体制备ELISA法检测抗血清的效价，取效价最高的老鼠，脾内注射10Ug抗原加强免疫，4d后，取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合［7］。用间接ELISA法［8］筛选阳性杂交瘤细胞株。经3次有限稀释法克隆化后，选择1株mAb持续分泌阳性的杂
8、交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞前1周，小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至（1〜2）X109/L,每只小鼠腹腔注射0.5mL,1周后小鼠腹部明显肿胀，消毒
