弓形虫棒状体蛋白rop7的生物信息学分析、原核表达及组织学定位

弓形虫棒状体蛋白rop7的生物信息学分析、原核表达及组织学定位

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1、分类号:S855.9单位代码:10193密级:公开学号:2012638硕士学位论文弓形虫棒状体蛋白ROP7的生物信息学分析、原核表达及组织学定位BioinformaticsAnalysis、ProkaryoticExpressionandHistologicalLocalizationofToxoplasmagondiiROP7作者姓名:闫晓月学位类别:农学硕士专业名称:预防兽医学研究方向:动物寄生虫病学指导教师:杨桂连副教授刘全副研究员所在学院:动物科学技术学院2015年05月独创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立进行研究所取得的成果。尽我所知,除文中特别

2、加以标注和致谢所列内容外,论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处,本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名:签字日期:年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定,即:研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有,并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学,学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,

3、可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人(同意/不同意,务必打印后填写)吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版(涉密学位论文解密后应遵守此协议)。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果,必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名:签字日期:年月日指导教师签名:签字日期:年月日摘要弓形虫病是一种呈世界范围流行的人兽共患寄生虫病。弓形虫病严重影响神经系统,眼部病变,新生儿全身性疾病,尤其是免疫系统薄弱的人。而免疫功能正常的成年人,感染通常无明显症状,一般为隐性感染。当机体免疫

4、力受到损伤,弓形虫隐性感染被激活,引起广泛的组织损伤和严重的病变,也是艾滋病患者死亡的主要原因。弓形虫不但危害人类健康,也严重的影响着畜禽牧业的发展,造成严重的经济损失。目前关于弓形虫病尚无良好的药物以及可实际商业化生产应用的疫苗,故寻找有效预防弓形虫病的疫苗是当前研究的方向。弓形虫顶端复合体—棒状体,在入侵宿主细胞与机体感染起着重要作用,其分泌的棒状体蛋白ROP7与弓形虫入侵宿主细胞有关,其在纳虫空泡上的拓扑结构还未确定,抗原表位及对宿主是否具有免疫保护性也不清楚。(1)本研究通过生物信息学技术对弓形虫棒状体蛋白ROP7的理化性质、是否含有信号肽和跨膜结构域、可溶性、二级结构及抗原

5、表位等进行了预测,结果发现弓形虫RH株棒状体蛋白ROP7基因全长为1728bp,编码575个氨基酸,N-端有一1-33位氨基酸的信号肽序列,12-34位氨基酸的跨膜结构域,具有多个翻译后修饰位点,多个抗原表位,这在理论上支持了弓形虫棒状体蛋白ROP7具有潜在的免疫源性,有成为候选疫苗基因的潜能。(2)根据生物信息软件的在线预测,将弓形虫RH株棒状体蛋白ROP7基因信号肽部位去掉,从余下的序列中截取561bp进行PCR扩增,将扩增的目的片段回收纯化后,克隆到pMD18-T载体,重组质粒pMD18-T-Tg2ROP7经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后,插入到pET-28a原核表达载体中,重组质

6、粒经测序鉴定正确的转入DE3感受态,经IPTG诱导,重组蛋白ROP7进行SDS-PAGE与Westernblot分析,重组Tg2ROP7表达大小为22kDa。NI-NTA进行纯化,透析后用PEG20000浓缩测定浓度为0.3mg/mL。(3)应用纯化的蛋白免疫小鼠,制备Tg2ROP7鼠源性多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶6400,并将其成功应用于弓形虫Tg2ROP7在弓形虫速殖子偏顶端的免疫荧光定位试验。本研究不但在理论上证明弓形虫棒状体蛋白ROP7具有抗原性,在技术上证明其作为弓形虫病核酸疫苗的可行性,同时还将生物信息学技术应用于弓形虫蛋白的预测,这都将为深入了解弓形虫入侵宿

7、主细胞机理、弓形虫病疫苗的研发和弓形虫诊断试剂盒的研制奠定基础。I关键词:弓形虫;ROP7;生物信息学;原核表达;间接免疫荧光IIABSTRACTToxoplasmosisisaworldwideepidemicdiseasessufferingfrompeopleandanimals.Toxoplasmosiscancauseseriousdiseasessuchasthenervoussystemdisease,eyediseaseandneonata

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