泛素相关蛋白dcn1p的原核表达、纯化、晶体筛选及相互作用蛋白分析

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1、”#日tnuDGj翌一密§：盐歪学技t嘲：10712Ⅱ究生学号：sY20¨“"⑩西北农林讲捉大学2007届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文泛素相关蛋白DcnlP的原核表达、纯化、晶体筛选及相互作用蛋白分析学科专业生物塑堡生研究方向生毖厦星芏研究生扬晓蕴指导教师酆逋五熟撞到塑五班珏县完成时间2四2至5目中圈陕西饷凌泛素相关蛋白Denlp的原核表达、纯化、晶体筛选及相互作用蛋白分析摘要泛素一蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasomepathway，UPP)不仅是一种破坏陈旧或损坏蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节细胞

2、周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程，uPP的异常与诸多疾病有密切关系。酵母(S．cereviciae)蛋白Dcnlp参与了UPP途径中E3复合物SCF的Neddylation作用，并能促进此UPP途径底物的降解。本研究的内容包括：运用基因工程技术克隆Denlp蛋白基因至表达载体；运用原核表达技术获得表达大量可溶性的Denlp全长蛋白；经亲和层析、FPLC系统O柱及SephadexG．200纯化全长蛋白；通过悬滴气象扩散法筛选蛋白晶体；在获知结构后，通过亲和层析和免疫印迹检测D

3、cnlp相互作用蛋白；采用表面等离子共振(SPR)进一步确定相互作用并获得结合常数。本研究的结论包括：1．获得了大量纯度达95％以上的Denlp蛋白；2．Denlp蛋白在100MmTrisHCI(Ph8．5)，30％PEGMME．5000，0．2M硫酸铵条件下获得了可用于数据收集并解析结构的晶体：3．在国内外首次获得Denlp蛋白晶体结构，分辨率为1．9A的晶体结构中包括第66--269位氨基酸残基的定位，符合正六面体空间排布，共由11个a一螺旋连接而成。4．在国内外首次提出并证实Rbxl同Dcnlp有弱相互作用，测得二者平衡结

4、合常数KA=3．72x105M～，进一步确定Dcnlp参与UPP以及Neddylation途径，也为Dcnlp参与构成Neddylation途径中E3复合物的推断提供了重要的新证据。本研究在结构分析的基础上探究Dcnlp的生物学功能，对Neddylation途径有了更为深入的了解，为泛素途径E3复合物SCF在细胞周期、有丝分裂中如何发挥作用提供新的依据和思路，对泛素途径相关的肿瘤、神经性疾病及炎症等疾病的研究具有重要的生物学意义。关键词：泛素途径；Dcnlp：原核表达；纯化；晶体筛选；RbxlPROKARYOTICEXPRESS

5、ION。PUⅪFICATION，CRYSTALLIZATIONOFDCNlPINPROTEINNEDDYLATIONANDANAL，YSISOFTHEPROTEINSINTERACTEDABSTRACTProteindegradationmediatedbyubiquitin-proteasomepathwayisallimportantmechanismwhichmodulatescellularproteins’activityandfunction．ModifieationofCullinsbyNedd8isimporta

6、ntfortheirubiquitinE3ligaseactivities．Dcnlp，anevolutionarilyconservedprotein，promotesCullinneddylationinvivo，bindsdirectlytoNedd8andassociateswitllCullinlinthebuddingyeastSacchromycescerevisiae．Inthispaper，inordertoknowmoreaboutthefunctionsofDenlp，firstrecombinantful

7、l·lengthyeastDcnlpasaGST-fusionprotein．GST-DcnlpwasexpressedinE．coli．RecombinantWaspurified0naglutathione-agarose(GSH)affinitycolumn,followedbyremovaloftheOST-tagwimthrombindigestion．FurtherpurificationofDcnlpWascarriedontusingsuccessivechromatographystepsonQandSuper

8、dex-200columns．Crystalsweregrownbythehangingdropvapordiffusionmethod．GST-pulldowntechnologyandwesternblottingWasusedtoscreentheprot