tiaml相互作用蛋白的筛选、鉴定及其功能的初步研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文Tiaml相互作用蛋白的筛选、鉴定及其功能的初步研究ScreeningandIdentificationofproteininteractingwithTiamlanditspreliminaryfunctionalstudies课题来源：国家自然科学基金(30801380，81101822)广州市科技计划重点项目(11C26090521)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院黄静陈龙华教授肿瘤学专业学位全日制博士第一临床医学院2013年3月20日广州博士学位论文Tiaml相互作用蛋白

2、的筛选、鉴定及其功能的初步研究ScreeningandIdentificationofproteininteractingwithTiamlanditspreliminaryfunctionalstudies博士研究生：黄静指导教师：陈龙华摘要研究背景和目的原发性肝细胞癌(HepatoceUularcaicinoma，HCC；简称肝癌)是世界上最常见恶性肿瘤之一。其死亡率位居全球恶性肿瘤死亡的第3位，在我国已上升至第2位，总体发病率和死亡率呈上升趋势。尽管近半个世纪来早期诊断、手术切除及药物治疗等方面不断发展，但肝癌患者的5年生存

3、率仍然很低。临床上有54．1％～61．5％的HCC在行根治性切除后5年复发。复发和转移仍然是影响肝癌预后的主要原因。因此，探讨与肝癌发生发展相关因素，寻找预防和治疗的有效途径，提高病人的生存率，降低死亡率是目前肝癌研究的重点。肿瘤发生发展是一个多步骤、多阶段的复杂过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱落，侵入血管或淋巴管，迁移、粘附于适宜部位，诱导肿瘤血管形成，对抗宿主抗肿瘤免疫，最终在远处形成转移灶。在这一过程中，涉及到多基因的参与。目前研究肿瘤发生发展机制大多关注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等单个或多个分子的作用和功能，而蛋白质作为基

4、因编码产物，是生命活动的最终执行者，其在肿瘤中的表达、对肿瘤发生发展所起的作用，仍有待阐明。近年中文摘要来开展的蛋白质组学技术为揭示肿瘤发生发展机制带来了新的希望，而对蛋白质的生物学功能研究也成为当前的研究热点。Tiaml(TlymphomainvasionandInetaStasisl，T淋巴瘤侵袭转移基因)蛋白是我们在前期研究中发现的肝癌转移相关蛋白。在前期研究中，我们通过对213例具有完整临床随访资料的肝癌组织标本进行了免疫组织化学检测，结果显示：Tiaml在肝癌组织中高表达，且表达水平与肝癌患者预后、转移密切相关，可以作为

5、判断肝癌患者预后的指标。Tiaml在8种肝癌细胞中的表达水平明显高于人正常肝细胞株。我们以人原发性肝癌高、低转移细胞株(HCCLM6，MHCC97L)为研究对象，采用基因转染和RNAi技术从细胞和动物水平证明了Tiaml过表达能促进肝癌增殖、侵袭、转移，相反沉默内源性Tiaml表达降低了肝癌增殖、侵袭、转移能力。研究结果为阐明肝癌转移机制及寻找预测肝癌转移的潜在标志物提供了理论依据。寻找Tiaml蛋白的相互作用蛋白是进一步理解Tiaml蛋白功能的一个重要途径。本研究拟在前期研究的基础上，利用酵母双杂交技术筛选Tiaml相互作用蛋白

6、，为阐明肝癌发生、发展机理，寻找肿瘤早期诊断和治疗的靶标提供重要理论依据。方法1．酵母双杂交筛选Tiaml相互作用蛋白1．1构建酵母双杂交诱饵表达载体首先应用基因重组技术，以商品化的人TiamlcDNA克隆为模板，构建Tiaml蛋白酵母表达质粒pGBKT7．Tiaml／C1199。将其转化到酵母菌株AHl09中，检测Tiaml蛋白在酵母菌株中的表达情况，分析有无毒性和自激活活性。1．2利用cDNA文库筛选Tiaml相互作用蛋白利用经典的PE肌m酵母转化法，采用大规模转化技术，以pGBKT7．Tiaml／C1199重组蛋白为诱饵，筛

7、选“UniversalHumanMate&Plate”文库。选取初筛获得的阳性克隆，进行质粒抽提、分离文库质粒和诱饵质粒、Ⅱ博士学位论文回复杂交验证。将获得的真阳性克隆进行测序分析和在NCBI数据库中进行Blast比对。2．交联免疫沉淀技术验证候选蛋白与Tiaml之间存在相互作用利用基因重组技术，分别构建了带有Flag和HA表位标签的候选蛋白和Tiaml-C1199真核表达载体。两种载体共转染人胚肾细胞HEK293T，加入含1％甲醛的PBS交联10min，超声裂解获取细胞总蛋白，将蛋白、抗体与ProteinG共同孵育，通过anti

8、-HA和anti-Flag的抗体分别进行免疫复合物沉淀，再以anti-Flag和anti-HA抗体进行westernblot检测，确定Tiaml和SETDBl、ZNF307是否存在相互作用。3．肝癌组织中SETDBl的表达检测及临床意义利用免疫组织