粒体蛋白mitofilin的鉴定及其功能的初步研究

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1、论文题目：自噬相关线粒体蛋白mitofilin的鉴定及其功能的初步研究答辩委员会主席：答辩委员会成员：温州医学院硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第二部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35第三部分材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63独创性

3、声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯663温州医学院硕士学位论文自噬相关线粒体蛋白mitofilin的鉴定及其功能的初步研究中文摘要目的l、建立饥饿诱导的HeLa细胞自噬模型以及相应的检测指标体系，并以蛋白质组学技术筛选自噬后发生表达变化的线粒体蛋白质。2、对筛选出的其中一个差异线粒体蛋白质mitofilin进一步进行验证，以确认其在自噬前后的差异表达。3、探索mitofilin与自噬的关系。方法1、HeLa细胞传代培养，采用饥饿法(以HBSS代替培养基)诱导HeLa细胞产生自噬。2、HeLa细胞自噬检测：

4、透射电镜检测自噬体的双层或多层膜结构形成；Westernblot检测正常HeLa细胞与自噬细胞的自噬体标记蛋白LC3。3、HeLa细胞传代培养，至细胞总量达到约1×108个左右时，采用饥饿法(以HBSS代替培养基)诱导HeLa细胞产生自噬，用试剂盒提取正常组与自噬组HeLa细胞线粒体蛋白。4、采用双向电泳(pH3—10)建立自噬状态下与正常状态下的线粒体差异蛋白质图谱。5、利用PDQuest对双向图谱进行分析，筛选出差异蛋白。6、采用LC／MS／MS质谱鉴定上述筛选到的差异蛋白并以Mascot等蛋白质搜索引擎检索Swis

5、sprot、NCBInr等数据库，获得蛋白质信息。7、Westernblot与Real-timePCR验证差异蛋白之一mitofilin在自噬前后的差异表达。8、克隆mitofilin基因，将其插入pcDNA3．1(+)．HA质粒构建真核表达载体，并合成其siIⅢA片段。9、构建将自噬体特异标记蛋白LC3基因克隆至真核表达载体pEGFP—C1并转染HeLa细胞，建立GFP—LC3／HeLa稳定细胞株，以便于对自噬相关蛋白的功能进行研究。10、采用RNAi和过表达技术，结合饥饿诱导模型与自噬检测体系，检测mitofilin

6、高表达／表达受阻的情况下是否诱导／抑制细胞自噬，从而研究其在自噬发生过程中的作用。4温州医学院硕士学位论文结果1、建立饥饿法诱导HeLa细胞产生自噬的模型及其检测体系，并摸索确定了线粒体提纯方法。2、筛选得到了自噬状态下与正常状态下的部分差异线粒体蛋白质。3、Westemblot与Real．timePCR验证mitofilin在细胞发生自噬时在mRNA水平与蛋白水平均下调。4、建立了稳定表达GFP．LC3的HeLa细胞株，为自噬相关蛋白质的功能研究提供了有利的实验模型。5、初步的RNAi结果显示mitofilin很可能参

7、与自噬进程。结论1、成功地建立了饥饿法诱导HeLa细胞产生自噬的模型及其检测体系。2、验证线粒体差异表达蛋白mitofilin，在细胞自噬时基因水平与蛋白水平均下调。3、建立mitofilin的过表达与RNAi体系，为探索mitofilin与细胞自噬及线粒体功能的关系打下基础。关键词自噬饥饿线粒体线粒体内膜蛋白RNA干扰5ABS’I。RAC。I’Objective1．Toestablishastarvation-inducedautophagicHeLacellsmodelandrelevantdetectionsySt

8、ems，andthenscreenoutthedifferentialexpressedmitochondrialproteinsintheprocessofautophagybyproteomicstechniques．2．Validmethedifferentialexpressionofmitofilinina