药细线人乳腺癌耐胞粒体p-糖蛋白研功能的初步究

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1、华中科技大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称ADM阿霉素AdriamycinCsACyclosporinA环孢素ADDPcisplatin顺铂DTTDithiothreitol二硫苏糖醇DMSODiamthylsulfoxide二甲基亚砜EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸EGTAEthylene乙二醇-双（2-氨glycol-bis(2-aminoethylether)-tetraaceticacid基乙醚）四乙酸IC5050%inhibitingconcentrat

2、ion半数抑制浓度KdKilodalton千道尔顿MDRMultidrugresistance多药耐药MTT3-[4,5-dimehyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-噻唑蓝2H-tetrazoliumbromideP-gpP-glycoproteinP-糖蛋白PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PMSFPhenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟Rho1232-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic罗丹明123Aci

3、dmethylesterRIResistanceindex耐药指数rpmrevolutionsperminute每分钟转速Taxolpaclitaxel紫杉醇1华中科技大学硕士学位论文人乳腺癌耐药细胞线粒体上P糖蛋白功能的初步研究前言[1]多药耐药（multidrugresistance，MDR）是当今肿瘤化疗失败最主要的原因之一，[2]其中P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的过度表达是产生MDR的主要机制。P-gp是一种由MDR1基因编码、ATP依赖性的跨膜蛋白，它可将抗癌药物或其它分子物质转运[3]至细胞外，

4、从而减少药物在细胞内的蓄积降低药物毒性。在P-gp的定位表达研究中，虽然多数认为其表达于细胞膜上，发挥外泵药物的作[4,5]用。但随着研究的深入，人们发现P-gp还有更复杂的亚细胞定位。Bendayan等在小鼠脑微血管内皮细胞和小胶质细胞核膜上检测到P-gp表达。后续在原代培养的鼠胶质细胞高尔基体、粗面内质网、胞质内囊泡和胞膜内陷小窝等结构上也发现了P-gp表达[6,7][8]，Ivanina等甚至在水产类动物牡蛎肝胰腺细胞线粒体上检测到P-gp表达。有关P-gp产生多药耐药机制的报道相继提出，细胞膜表面的P-gp将药物泵出细胞

5、外并不是其介导耐药产生的唯一机制。人们发现，P-gp在耐药细胞的细胞器膜上，包[9-13]括核膜、高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体膜上有高表达，同时这些部位的P-gp[9]导致化疗药物在肿瘤细胞内异常分布也与耐药有一定的关系。Calcabrini等的研究提[14]出，P-gp在细胞核上的表达是阻止药物进入核区的直接原因。Hurwitz等在研究白血病细胞U937内阿霉素分布证实，溶酶体作为储存化疗药物的主要“隔离器”，使药物远离其作用靶点—细胞核而介导耐药。但也有研究提出分隔储留药物的细胞器是高尔基[15]体和内质网。这些细胞器储

6、留药物，使其不能到达细胞核靶点而产生耐药。加入P-gp阻断剂维拉帕米可恢复药物在耐药细胞核的弥漫分布，表明P-gp在这些过程中发挥了[14,15]作用。线粒体不同于高尔基体、溶酶体等细胞器，它具有独立的遗传基因，是ATP的主要生产中心，在细胞生长代谢过程中发挥决定性的作用。而表达于线粒体P-gp的功能，6华中科技大学硕士学位论文[12]目前仍存在争议。Munteanu等对白血病K562细胞线粒体上P-gp的研究提出，它将药物泵入线粒体，使线粒体成为储留药物的细胞器，通过改变药物在细胞内分布，降低药物对细胞核的损伤而介导耐药。然而

7、转运入线粒体内的药物，难免对线粒体DNA[16]造成氧化损伤，导致细胞凋亡，这与细胞耐药相矛盾。那么线粒体上P-gp是否有功能活性，它又是怎样发挥功能的？我们前期实验已证实P-gp在耐药细胞MCF-7/ADM线粒体上表达，在此进一步研究线粒体P-gp的功能及探讨其在肿瘤耐药机制中的可能作用。我们以分离纯化得到的细胞线粒体为研究对象，运用流式细胞术检测各细胞线粒体中Rho123的平均荧光强度，比较加入CsA后，各细胞线粒体中Rho123的摄取和外排的变化，反映线粒体P-gp的泵功能，探讨线粒体P-gp在肿瘤耐药中的可能作用，为肿瘤

8、耐药机制提供一条新思路。7华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、研究对象亲本细胞株MCF-7购于武汉大学生物保藏中心，其阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM为本实验诱导产生。二、主要仪器设备1．超净工作台：美国HealForce公司2．二氧化碳恒温培养箱：美国He