与cvb3 3a相互作用的人心脏蛋白的筛选及功能初探

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1、分类号：密级：UDG：学号：406520312359南昌大学硕士研究生学位论文与CVB33A相互作用的人心脏蛋白的筛选及功能初探ScreeningofhumanheartproteinsthatinteractwithCVB33Aandpreliminarystudyofthebiologicalfunctions张静怡培养单位（院、系）：南昌大学基础医学院指导教师姓名、职称：黄孝天教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：病原生物学论文答辩日期：2015-06答辩委员会主席：评阅人：2015年6月一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进

2、行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫

3、描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目姓名学号论文级别博士□硕士□院/系/所专业E_mail备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要目的：运用酵母双杂交技术，从人心脏cDNA文库中筛选与CVB3非结构蛋白3A相互作用的人细胞蛋白；

4、选取阳性蛋白之一的TMED4进行研究，探讨CVB33A与TMED4的相互作用及其生物学意义，为进一步研究CVB3的致病机制及治疗CVB3引起的相关疾病提供新的方向和依据。方法：1.以病毒RNA为模板，逆转录合成cDNA，再经PCR扩增出3A基因，并将其重组至真核表达质粒pGBKT7中，构建诱饵质粒pGBKT7-3A；2.采用乙酸锂法将诱饵质粒pGBKT7-3A转化至酵母菌AH109中；3.WesternBlot检测融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[pGBKT7-3A]中的表达；4.SD/–Ade/–Trp和SD/–His/–Trp营养缺陷培

5、养基及X-α-Gal实验检测3A对报告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的转录自激活作用，小规模配合实验检测酵母菌的配合功能；5.大规模配合筛选与3A蛋白相互作用的人细胞蛋白；6.采用表型鉴定、PCR扩增和AluI酶切等实验方法对筛选所得阳性候选克隆进行归类、测序及同源性比对分析；7.SD/–Ade/–Leu和SD/–His/–Leu营养缺陷培养基的鉴定方法及X-α-Gal实验检测筛选所得阳性质粒pGADT7-ADx对报告基因（HIS3、ADE2和MEL1）的转录自激活作用，利用回返配合实验初步验证3A蛋白与各阳性蛋白的相互作用；8.质粒pBudCE4.1-3A

6、转染HeLa细胞36h后，采用免疫荧光双标技术，用AlexaFlour488山羊抗兔二抗（绿色荧光）与兔抗TMED4的特异性结合来标记TMED4在细胞内的定位，用Rhodamine山羊抗鼠二抗（红色荧光）与鼠抗His-Tag的特异性结合来标记3A在细胞中的定位，利用高内涵细胞成像分析系统观察3A蛋白与TMED4在细胞内的共定位情况，同时设立正常细胞作为阴性对照；II摘要9.质粒pBudCE4.1-3A转染HeLa细胞48h后，收集细胞蛋白裂解液，分别采用anti-TMED4或anti-His-Tag进行细胞内免疫共沉淀，进一步验证3A蛋白与阳性蛋白TMED4之间的

7、相互作用；10.收集质粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1转染后24h、36h、48h各时间点细胞，加入CCK-8溶液后酶标仪检测波长490nm处各样品OD值，采用SPSS13.0软件对结果进行分析；11.收集质粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1转染后24h、36h、48h各时间点细胞，使用AnnexinV试剂盒对早期凋亡细胞进行染色后，高内涵细胞成像分析系统对早期凋亡细胞进行计数分析；12.质粒pBudCE4.1-3A对细胞周期的影响：以G1/S期为切入点，收集质粒pBudCE4.1-3A和pBudCE4.1转染后24h、36h、48h、5

8、4h各时间