丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白hcbp12在hepg2细胞中的相互作用论文

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1、丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用论文【摘要】目的：使用哺乳动物双杂交系统探讨HCVcore与HCBP12在人肝癌细胞HepG2细胞中的相互作用.方法：PCR分别扩增含HCVcore及HCBP12的cDNA片段，克隆入pGEMT载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳动物双杂交的表达质粒PBIND和PACT中，并转染HepG2细胞，48h后检测细胞中报告基因luciferaseactivity的表达水平.结果：DualLuciferaseActivety系统检测

2、显示PBINDcore与PACTHCBP12实验组萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显高于其他阴性对照组，但低于阳性对照组.结论：哺乳动物双杂交系统证实HCV核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在人肝癌细胞系中HepG2中有一定的相互作用，为进一步研究HCVcore和HCBP12的功能奠定基础.【关键词】肝炎病毒病毒核心蛋白质类HCBP12哺乳动物双杂交系统基因报告0引言丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）核心区位于HCV基因组的342～914nt.freelmalianT，Pure

3、YieldTMPlasmidMidiprepSystem，DualLuciferaseReporterAssaySystem（美国Promega公司）；克隆有HCV核心蛋白cDNA的质粒3.1HCVcore，32aHCBP12由本室保存；PCRTaq酶（北京鼎国生物有限责任公司）；DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；玻璃奶DNA凝胶回收试剂盒，Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；测序由上海生工公司完成，HepG2细胞本室；Turne

4、rBioSystemsVeritasMicroplateLuminometer（购自美国BIO公司）.1.2方法1.2.1用PCR扩增HCV核心蛋白(core)和HCBP12基因分别根据core基因和其最终载体PBIND的序列,设计克隆编码核心蛋白基因的引物为下游P1：5′gATATCggTgAAgCgggCACA3′；上游引物P2：5′gATATCTTAggATgCCATgCCAAgCAg3′；以质粒3.1HCVcore为模板，PCR反应条件为：94℃30s，65℃30s，72℃40s，

5、35个循环;HCBP12基因和其最终载体PACT,克隆编码HCBP12蛋白基因的引物为上游P1：5′gTCgACTTATggTTgAgcTCATgTTCC3′；下游引物P2：5′gATATCTTAgTCTATTgggAggCCCAgC3′；以32aHCBP12为模板，PCR反应条件为：94℃30s，65℃30s，72℃60s，35个循环.1.2.2PCR产物克隆及鉴定将纯化回收的目的core及HCBP12基因片段分别与pGEMT载体在16℃条件下用T4DNA连接酶连接过夜，转化入大肠埃希

6、菌DH5α感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃孵育16h.挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为pGEMTcore及pGEMTHCBP12，分别进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定.证明目的基因片段已插入pGEMT载体中后送生物公司测序进行分析.测序显示正确后用BamHⅠ/EcoRⅤ从pGEMTcore克隆质粒上酶切目的基因片段core，用SalI/EcoRⅤ从pGEMTHCBP12质粒上酶切目的基因片段HCBP12,10g/L琼脂

7、糖凝胶电泳纯化回收目的片段.1.2.3构建及鉴定真核表达载体用BamHⅠ/EcoRⅤ双酶切表达载体PBIND，SalI/EcoRⅤ双酶切PACT，回收双酶切产物PBIND和PACT，载体片段与已经回收的要插入的插入片段core和HCBP12连接后转化大肠埃希菌DH5α，铺于含有氨苄青霉素的LB平板上37℃孵育18h.挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为PBINDcore及PACTHCBP12，并分别用进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定,证明目的基

8、因片段已插入真核表达载体中后,送生物公司测序进行分析.测序正确后，应用转染级质粒提取试剂盒PureYieldTMPlasmidMidiprepSystem进行大规模的质粒提取和纯化.1.2.4转染HepG2细胞按双杂交系统说明于转染前1d设计转染的样本，同时设阴性和阳性对照组.共转染6组细胞，每组3个复孔，于24孔板培养平板的18孔每孔加500μL不含双抗（氨苄和庆大霉素）的DMEM培养基，胰酶消化细胞，计数并接种18孔，细胞密度为1×105个/孔，可使转染当日细胞融