法氏囊活性肽bp5肿瘤细胞相互作用蛋白的筛选及鉴定

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文法氏囊活性肽BP5肿瘤细胞相互作用蛋白的筛选及鉴定ScreeningandidentificationofBursopentin(BP5)interactingproteinsintumorcells学位申请人：郭香玲指导教师：吴庭才教授、王臣副教授一级学科：兽医学二级学科：预防兽医学学位类别：农学硕士2015年06月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大

2、学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：论文题目：法氏囊活性肽BP5肿瘤细胞相互作用蛋白的筛选及鉴定专业：预防兽医学研究生：郭香玲指导教师：吴庭才、王臣摘要法氏囊（bursaofFabricus,BF）是禽类特有的体液中枢免疫器官，负责B细胞的发育和抗体的分泌。法氏囊活性肽BP5（Bursopentin）是从鸡BF中分离到的一种新的免疫活性肽，不仅能够调节体液免疫和细胞免疫反应，还具有抗氧化和抗肿瘤活性。目前，BP5抗肿瘤的作用机制尚不

3、清楚。本研究旨在利用噬菌体展示技术，结合BP5诱导的肿瘤细胞基因表达谱分析及生物信息学分析，以期筛选出BP5肿瘤细胞相互作用蛋白并对其进行初步鉴定，同时初步揭示BP5抗肿瘤作用机制。本研究主要包括以下三个方面的内容：1、法氏囊BP5特异性结合肽的筛选及鉴定利用噬菌体展示技术，以BP5-BSA为靶分子对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选，结合ELISA鉴定和竞争抑制试验，筛选出3个BP5特异性结合肽，分别为：PINMQTLNCMAA（P2-12）、GCTLNPMSDLLG（P6-12）和MSSTLNGMLNSL（P7-12），其核心基序为TL

4、NXM。采用MTT法检测其对BP5抗肿瘤细胞增殖能力的影响，结果显示，P2-12和P7-12肽在0.2-20μg/mL下，P6-12在2-20μg/mL浓度下均能抑制BP5抗小鼠WEHI-231细胞增殖作用，其中P2-12在2-20μg/mL浓度下抑制作用最显著（p<0.01）。此外，p53荧光素酶检测活性结果显示，3种BP5结合肽在实验浓度下均能下调BP5促p53基因转录活性。表明这3种BP5特异性结合肽均能下调BP5的抗肿瘤活性。为研究BP5的抗肿瘤作用机制奠定了基础。2、鸡DT40细胞cDNAT7噬菌体文库的构建及BP5鸡DT40细胞

5、相互作用蛋白的筛选以鸡DT40细胞为肿瘤细胞模型，利用T7噬菌体展示技术构建鸡DT40细胞cDNAT7噬菌体文库，并以BP5-BSA为靶分子对文库进行亲和筛选，结合序列测定和生物信息学分析，筛选BP5鸡DT40细胞相互作用蛋白。结果显示，构建的鸡DT40细胞cDNAT7噬菌体文库原始滴度为1.2×104pfu/mL，扩增后滴度达1.9×109pfu/mL，文库重组率为91.7%，且插入片段大多在250-1000bp。随机选取12个PCR产物进行测序，结果显示插入序列均为鸡源序列。通过I三轮亲和淘选，结合序列测定获得3条与BP5结合的鸡源蛋白

6、运输蛋白颗粒复合体2（TRAPPC2，traffickingproteinparticlecomplex2）、血管内皮生长因子A（VEGFA，vascularendothelialgrowthfactorA）和细胞周期蛋白E1（CCNE1，cyclinE1）。生物信息学分析发现鸡的TRAPPC2与小鼠和人的TRAPPC2的同源相似性分别为97.9%、100%，鸡的VEGFA与小鼠和人的VEGFA的同源相似性分别为76.8%、74.1%，鸡的CCNE1与小鼠和人的CCNE1的同源相似性分别为67.3%、71.3%，其中，VEGFA是血管生成的

7、重要调控因子，CCNE1是调控细胞周期G1/S期的重要的细胞周期调节蛋白，二者的异常表达均与肿瘤的发生和发展密切相关，提示BP5的抗肿瘤作用可能与VEGFA和CCNE1相关，为进一步研究BP5肿瘤细胞相互作用蛋白提供科学依据。3、BP5刺激的鸡DT40细胞基因表达谱分析以BP5刺激鸡DT40细胞，通过基因芯片技术来分析BP5刺激后鸡DT40细胞中基因表达谱的变化情况。结果显示，BP5参与调节多条与抗肿瘤功能有关的通路，其中包括p53信号通路，且p53信号通路涉及的5个差异表达基因均与细胞周期调控或抗肿瘤相关，其中SIAH1、TP53(p53

8、)、CIP1(p21)基因被上调，CHEK2、CCNE1基因被下调。BP5依赖p53肿瘤信号通路分析结果显示，在转录水平上，BP5在0.2-20μg/mL浓度下能够明显提高HCT