筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白-论文.pdf

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1、安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Jul；49(7)·879·筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白李小勤，唐宜桂，刘琛，雷婷，秦宜德摘要目的采用pull-down技术筛选乳源抗癌六肽(PG-1材料与方法PIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上的靶点蛋白(受体)并进行鉴定。方法以PGPIPN的序列为参照，设计出PG—1．1材料和试剂PIPN基因，以BamHI／XhoI为酶切位点，将PGPIPN基因1．1．1细胞株和菌株SKOV3、大肠杆菌E．coli构建到表达质粒载体pGEx_4T-1中，转化到E．coliB

2、I~1中，DH5ot和E．coliBL21、质粒pGEx4T一1均由安徽医用诱导剂异丙基．$一D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)低温诱导表科大学生物化学实验室保存。达的谷胱甘肽s转移酶(GST)标签融合蛋白作为诱饵蛋白；1．1．2试剂胎牛血清购于杭州四季青公司；RP—从SKOV3中提取的总蛋白作为捕获蛋白，运用GSTpull—MI1640培养粉购于美国Gibco公司；快速银染试剂down技术，筛选出靶点蛋白质，运用SDS-PAGE电泳进行初步鉴定，并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的PGPIPN孵育鉴盒(BSP029S．N)、细菌活性化蛋白制备裂解液、质粒定。结果S

3、DS—PAGE电泳中有两条条带，一条为诱饵蛋提取试剂盒、一步法感受态制备溶液SSCS均购于白，一条为目的条带，在免疫荧光显微镜下观察到荧光PG—上海生工生物工程有限公司；PGPIPN基因由上海生PIPN结合到该条带上。结论筛选和鉴定了PGPIPN作用工生物工程有限公司合成；限制性内切酶BamHI于卵巢癌细胞上的靶蛋白，为研究其抗癌的作用机制及其信和XhoI购于加拿大Fermentas公司；pull-down试号转导通路奠定了基础。剂盒购于美国Thermo公司；PGPIPN和荧光标记的关键词乳源抗癌六肽；GSTpull—down；诱饵蛋白；捕获蛋PGPIPN均由上海

4、楚肽生物科技有限公司合成，纯度白；靶点蛋白>98％；电喷雾质谱(ESI．MS)分析鉴定在中国科学中图分类号R392．11；R394．2技术大学实验室完成。文献标志码A文章编号1000—1492(2014)07—0879—041．2实验方法1．2．1pGEx4T．1一PGPIPN载体的构建及鉴定参乳源抗癌六肽(Pro·Gly-Pro-Ile-Pro—Asn，PG—照GenBank所报道的编码序列，在基因两端分别加PIPN)是来源于牛酪蛋白酶解的产物，B一酪蛋白的上BamHI和XhoI酶切位点、终止密码子及保护63～68段残基。因其具有免疫活性，最早被称为乳碱基，设计

5、出PGPIPN的基因序列如下：GGCGATC-源免疫调节肽。研究表明PGPIPN具有抗CCCTGGGCCGATCCCTAACTAGCTCGAGCGG，其中癌功能，尤其是抗妇科癌症，例如乳腺癌等，且其具下划线分别为BamHI和XhoI酶切位点。将PG．有抑制卵巢癌原代细胞和卵巢癌细胞株(SKOV3)PIPN基因和质粒pGEX-4T一1分别双酶切后连接转细胞生长和增殖，诱导卵巢癌细胞发生凋亡，显示了化到E．coliDH5c~中，铺于LB／氨苄青霉素(Ampr)很好的抗癌前景和开发潜能。研究PGPIPN抗卵巢板上，挑选阳性克隆，提取质粒并酶切测序鉴定。癌的作用机制及其信

6、号途径显得非常的重要和迫1．2．2诱饵蛋白的诱导表达及其产物的SDS-切，要研究其作用机制和信号途径，首要是靶点的筛PAGE鉴定将经测序正确的重组pGEX-4T一1一PG—选和鉴定。该研究通过pul1．down技术筛选PG—PIPN质粒转化到用于表达的BL21菌株感受态中，PIPN作用于SKOV3的靶点蛋白，以期为进一步研铺于LB／Ampr板上，37℃过夜培养。挑选单克隆究PGPIPN的抗肿瘤功能机制奠定基础，同时为临接种到10ml含100mg／LAmpr的LB培养液中，培床新药的开发提供新的方向和途径。养至0D枷值约为0．6时，在菌液中加入终浓度为2014～02

7、—17接收0．5mmol／L的异丙基一B．D一硫代吡喃半乳糖苷基金项目：国家自然科学基金(编号：30872992)(IPTG)，在37℃、220r／min震荡条件下诱导表达4作者单位：安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥h，以10000r／rain4o【=离心5min，弃上清液，沉淀23oo32用TBS洗3次，用细菌活性化蛋白制备裂解液试剂作者简介：李小勤，女，硕士研究生；秦宜德，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail盒裂解细菌，离心后收集上清液。同时进行未诱导qinyide@hotmail．com重组菌和表达载体BL-21的培养，收集裂解液。

8、将·882