基于vegfr靶点的肿瘤靶向抑制肽的改造、筛选及鉴定

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1、第三军医大学硕士学位论文基于VEGFR靶点的肿瘤靶向抑制肽的改造、筛选及鉴定姓名：冯世斌申请学位级别：硕士专业：影像医学与核医学指导教师：李前伟201205第三军医大学硕士学位论文基于VEGFR靶点肿瘤靶向抑制肽的改造、筛选及鉴定半摘要研究背景及目的肿瘤的生长、侵袭、转移均依赖于血管生成，抗肿瘤血管生成具有良好的应用前景。血管内皮细胞生长因子VEGF为最主要的血管生成促进因子，它通过与胞膜上的VEGF受体(VEGFR)特异结合而发挥促血管生成作用，其中VEGFR．1(Flt—1)及VEGFR一2(KDR)高表达于肿瘤细胞及新生的血管内皮细胞，

2、在其它细胞中极低表达或不表达，在肿瘤血管生成中处于核心地位，与肿瘤的生长与转移密切相关，阻断VEGFR的功能可抑制VEGF的促血管生成作用。因此，以VEGF／VEGFR为靶点开展的抗肿瘤血管生成研究成为当前的研究热点之一。VEGFl25m6为VEGF—A外显子6编码的12肽QKRKRKKSRYKS，能与VEGFR特异结合但不激活VEGFR，对VEGFR起封闭作用，从而竞争抑制VEGF的促血管生成，有望作为肿瘤核素靶向显像或核素治疗的侯选分子。上一国家自然科学基金课题(30400114)结果提示：①188Re—VEGFl25．136明显靶向聚集

3、于荷瘤裸鼠的肿瘤组织，抑制肿瘤生长；②肿瘤组织转染截短KDR基因后，明显增加了188Re—VEGFl25-136在肿瘤部位的聚集量。即该标记物在肿瘤的靶向显像及治疗方面具有较好的应用前景，但它在肿瘤组织的滞留时间仅3小时。进一步提高标记物在肿瘤组织的聚积量(提高瘤／非瘤比值)与滞留时间，以增强抗肿瘤作用为本研究需要深入探讨的重点。提高多肽与受体问的亲和力是提高标记物在肿瘤组织聚积量与滞留时间的有效途径。配体与受体结合的可逆性是受体的最基本特性之一，而亲和力是衡量配体一受体结合能力及稳定性的重要参数：亲和力越高，配体与受体越易结合，结合之后的复

4、合物越稳定，不易发生解离。本研究旨在探讨VEGFl25-136的改造及筛选目标多肽的方法，然后对目标多肽的99Tcm标记方法探讨，标记多肽在荷瘤裸鼠的体内分布及SPECT]}中瘤靶向显像，为进一步的肿瘤靶向显像及靶向治疗奠定实验基础。研究方法+本课题受国家自然科学基金资助(No．30970848)9第三军医大学硕士学位论文1．多肽VEGFl25郴6的生物信息学改造：结合分子对接法及表面基团相互作用法对VEGFl25．136进行改造，获得理论上与VEGFR间具有更高亲和力的多肽。2．体外受体竞争结合实验验证多肽与VEGFR的亲和力，3H—TdR

5、参入实验验证多肽对肿瘤细胞增殖的影响，从上述多条多肽中筛选得到目标多肽。3．目标多肽的放射性核素标记及鉴定：选用合适的双功能螯合剂偶联多肽，探讨目标多肽的最佳标记条件，纸层析法和HPLC法鉴定多肽的标记率、放射化学纯度及体外稳定性。半胱氨酸置换实验验证99Tc“与多肽的螯合能力。体外受体竞争结合实验鉴定标记多肽的体外受体结合活性。4．标记多肽的药代动力学研究：取日本大耳兔8只，每只经左耳缘静脉注射lmCi／2009l标记多肽，分别于注射后1．5、3、5、10、30、60、120、240、480min从右耳缘静脉抽血测量血样放射性浓度，应用药物

6、代谢动力学分析软件(DAS3．0)分析多肽最佳方式模型及示踪动力学参数。5．标记多肽在正常昆明小鼠体内分布研究：15只昆明小鼠经尾静脉注射标记溶液7．4MBq／200}tl，分别于30min、lh、2h摘眼球法收集血液并将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、甲状腺、骨、肌肉，分别称重并测放射性，经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID／g)。6．日本大耳白兔显像研究：耳缘静脉注射标记溶液o．5mCi后立即以1帧／min采集60min，并于90、120、180、240min预置计时5min采集图像一帧，观察各器官的放

7、射性分布动态变化。7．标记多肽在荷瘤裸鼠体内显像及竞争抑制显像研究：荷瘤裸鼠注射标记目标多肽物(11．1MBq／只)后0．5h、1h、1．5h、2h、3h、4h行SPECT平面预置计时(10min)显像。注射目标多肽lmg后注射标记目标多肽物(11．1MBq／只)，O．5h、lh行SPECT平面预置计时(10min)显像，评价目标多肽与肿瘤组织结合的特异性。实验结果1．生物信息学方法改造VEGFl25-136并经体外实验验证获得了两条与VEGFR受体亲和力高且可以明显抑制肿瘤细胞增殖的多肽：QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYⅣLS

8、。2．目标多肽的放射性核素标记及鉴定：目标多肽选用HYNIC为双功能螯合剂，标记方法如下：在2ml细胞冻存管中依次加入20pg多肽，HYNIC—QKRKRKKsRK