肝癌组织靶向肽的筛选与鉴定

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1、万方数据分类号：R73s．7密级：学位类别：科学学位日专业学位口学校代码：1062学号：2011602215学科门类：医学又肄眚耕袁鼍硕士学位论文M_ASTER’SDISSER，rATIoN论文题目：肝癌组织靶向肽的筛选与鉴定TITLEScreeningandidentificationofhepatocellularcarcinoma-targetingpeptidesbyphagedisplay一级学科：生物医学工程二级学科：生物医学工程论文作者：赵静雯指导教师：尹海芳教授导师组成员：天津医科大学研究生院二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明

2、IIll

3、IIILLIllilIIIIIIIIllllllllIIY2698276本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或

4、机构送交论文，并编入有关数据库。保密l，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囹。(请在相对应的方框内打“√”)万方数据天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：肝细胞癌(HcpatocellularcarciIlom盈HCC)是一种常见且致死率极高的恶性肿瘤，目前对于肝癌的诊断与治疗仍存在诸多难点与瓶颈，特别是临床上应用的抗肿瘤药物，由于缺乏靶向性，对患者造成了极大的副作用。抗肿瘤药物的靶向性运输是肿瘤治疗研究中的重要内容，对提高药物的治疗效率和减少毒副作用具有重要的意义。本研究拟利用噬菌体展示文库及活体切片技术相结合，通过体外生物淘选，进行新型肝癌组织特异

5、性短肽的筛选和鉴定，以期获得更高效、特异的肝癌组织靶向肽，为抗肿瘤药物的靶向性运输提供适合的载体。方法：1．将噬菌体随机展示文库以1x1011p缸在3种人肝癌细胞系SlVIMC．7721、HepG2、MHCC．LM3上进行减性筛选，将不与人正常肝细胞H7702结合的噬菌体文库与肝癌细胞孵育，经过3---,5轮的体外淘选，筛选肝癌组织靶向短肽，随机挑选30--一50个最后一轮回收的噬茵体单克隆，提基因组DNA后测序。2．利用C57BL／6小鼠建立肝活体切片系统，优化肝活体切片的体外培养条件，并从形态学、细胞染色、ATP含量及LDH酶活性四个方面检测肝活体切片在

6、体外培养的活力和生存周期，以确定最佳的筛选时间。3．取临床病人肝癌标本，利用噬菌体随机展示文库以1x1011pfu在人肝癌活体切片上进行四轮体外生物淘选，随机挑选30个最后一轮回收的噬菌体单克隆进行常规测序，并利用高通量二代测序对第二轮富集的噬菌体文库进行测序筛选，获得重复率高的候选短肽序列。4．根据单克隆测序结果确定候选噬茵体，将1x1011pfu候选噬菌体及无插入片段的对照噬菌体在人肝癌活体切片上进行特异性结合验证，孵育2小时后回收结合的噬菌体，测定滴度。5．根据测序结果确定候选靶向短肽，荧光标记合成，以50M的浓度与人正常肝细胞系及3种肝癌细胞系共孵育

7、6小时，利用荧光显微镜和流式细胞仪鉴定各细胞系对短肽的摄取情况。6．将6条荧光标记的候选靶向短肽以50M的浓度与高转移性人肝癌细胞系万方数据天津医科大学硕士学位论文MHCC—LM3及4种人其他肿瘤细胞包括人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MDA·MB-231、人肾癌细胞CRL．1932以及人肺癌细胞A549共孵育6小时，利用荧光显微镜和流式细胞仪鉴定各细胞系对短肽的摄取情况，验证候选靶向短肽对肝癌细胞的特异性。7．将1x107的HepG2细胞皮下注射到BabL／c裸鼠背部，待皮下瘤长至lem左右，剥离剪成1咖3的组织块原位接种到裸鼠肝脏中，建立原位肝癌模型鼠

8、。8．选取候选靶向短肽P46和P47，以25mg／kg的剂量通过尾静脉注射到肝癌裸鼠模型体内，30分钟后利用小动物成像系统对候选短肽进行组织分布验证。结果：1。在3种不同人肝癌细胞系中的体外淘选，经测序未找到重复序列。2．从四个方面检测肝活体切片的活性，证明肝活体切片在培养12小时内形态正常。活性良好，可以用于噬菌体筛选。3．在人肝癌活体切片上进行四轮筛选，通过常规基因组测序和高通量二代测序确定6条候选靶向短肽及3个候选噬菌体。4．候选噬菌体P1、P5和P20在人肝癌活体切片中的富集程度均高于对照噬菌体，说明候选噬菌体对肝癌有一定的结合能力。5．在细胞摄取试

9、验中，我们发现6条候选短肽在不同人肝癌细胞中表现出不