肝癌血清核酸适配子的筛选及其鉴定

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另tlDN以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：诲盐驴签字同期：加『J年占月，尹日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复

2、印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：傅&嘻导师签名(手写)：吾长胁签字同期：pff年石月哗日签字日期：≯t7年苦月I2／日学位沦文作者毕业后去向：工作单位：茹塘豹闷中唐医阮通讯地址：南昌争胤素泉醒习7堇电话：D77t-

3、∽二缈邮编：弓叫摘要背景与目的：晚期肝癌患者的平均生存期只有几个月，改善患者预后的关键是早期发现和早期治疗。肿瘤标志物是目前肝癌早诊的主要手段之一，但由于肿瘤细胞的异质性，AFP等经典肝癌标志物并不能满意地解决肝癌的早期诊断。近年来蛋白组学等生物高新技术的问世有力地促进了肝癌标志物的研究，发现了具有应用前景的GPC3、GP73等新标志物。因此，采用生物高新技术探索肝癌诊断新技术成为目前的研究热点。SELEX技术是一种组合化学新技术，应用该技术可从人工合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选出能与靶分子高特异性、高亲和力

4、的核酸适配子。适配子功能类似抗体，但某些特性优于抗体，在疾病的诊断中显示出了良好的应用前景。SELEX技术的一个突出特点是可以“盲筛”获得未知靶分子的特异性适配子。肝癌血清中含有己知和未知肝癌标志物，作为SELEX“盲筛”靶标，有可能获得一组已知和未知肝癌血清标志物的适配子，为肝癌诊断，特别是早期诊断开辟新途径。因此，本研究将以肝癌血清为靶标进行适配子的SELEX筛选，旨在为建立基于适配子的肝癌诊断新技术奠定基础。方法：(1)血清靶标收集：收集20例经手术和病理证实的原发性肝癌患者的术前血清，以及20例检查无异

5、常的正常体检者的血清，并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和『F常混合血清(消除个体差异)，用作SELEX筛选的血清靶标。(2)核酸文库及引物设计与合成：采用本课题组自行设计并一直沿用的单链随机寡核苷酸文库和引物，由生物试剂公司合成。(3)消减SELEX筛选：先用正常混合血清进行3轮消减SELEX筛选，以去除文库中与正常血清成分结合的核酸序列，即将正常混合血清与合成的文库孵育结合、聚丙烯酰胺凝胶分离并切胶回收游离核酸、不对称PCR扩增回收的核酸、聚丙烯酰胺凝胶回收并纯化单链产物并实时PCR荧光定量，以此为亚文库进

6、行下一轮筛选。(4)肝癌血清复合靶SELEX筛选：以肝癌混合血清为靶标进行10轮左右SELEX筛选，以获得肝癌血清特异的核酸序列，即将肝癌混合血清与消减筛选后的文库孵育结合，聚丙烯酰胺凝胶分离并切胶回收结合核酸，不对称PCR扩增、切胶回收、纯化及实时PCR定量单链产物用作下一轮的文库，重复筛选。(5)分离单一适配子并进行结构分析：以最后一轮筛选后的亚文库为模板进行PCR扩增，扩增产物送生物试剂公司克隆分离核酸序列并测序，采用RNAstructure4．5软件摘要对测序结果进行二级结构的模拟分析，采用Clusta

7、l软件对适配子序列进行聚类分析，划分家族，同一家族进行同源性比对。(6)适配子的特异性分析：将梯度适配子量(2～6pm01)分别与肝癌混合血清、正常混合血清孵育，通过聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳观察结合情况，QuantityOne凝胶分析软件测定游离适配予带的灰度值，并计算『F常混合血清与肝癌混合血清游离适配子的灰度比值，评价适配子与肝癌血清结合的特异性。(7)适配子的亲和力分析：将梯度量(1-Spm01)的适配子与肝癌混合血清孵育结合、聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳后测定结合条带灰度值，采用Graphpadprism5．0

8、1软件测定解离常数(Kd)。(8)适配子与单个肝癌血清标本结合的特异性分析：选择代表性适配子与单个肝癌血清标本和正常血清标本孵育、聚丙烯酰胺凝胶阻滞电泳观察结合适配子与血清结合情况，测定游离带灰度值，计算其与适配子对照的比值，ROC曲线评估适配子对肝癌的诊断价值。结果：(1)肝癌混合血清适配子筛选与分离：经过3轮消减筛选，与正常血清结合的核酸减少；经过9轮正向SELEX筛选，亚文库通过