肝癌细胞特异性结合短肽的噬菌体肽库筛选

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1、顽十学位论文中文摘要摘要肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，发病率呈不断上升趋势。目前，它的治疗主要以手术、化疗和放疗为主，患者5年生存率不到50％，且不能切除肿瘤的患者5年生存率为0。因而迫切需要有创新性、突破性的早期治疗手段，而肿瘤基因疗法为此提供了一条新思路。其中，以纳米载体作为基因治疗的运载体，已逐渐成为此领域中的一个十分重要的研究方向。然而，无论是离体基因治疗(ex-vivo)，还是体内基因治疗(in-vivo)，都必须解决如何使纳米载体携带的目的基因能够靶向转移并高效表达的

2、问题。迄今，肝癌基因治疗的效果仍然不能令人满意，缺乏可利用的针对肝癌细胞的高靶向性分子是其重要的障碍。为此，筛选肝癌细胞特异性靶向分子。并将其与纳米基因载体结合，已成为提高纳米基因载体肝癌治疗效果的关键问题之一。为实现纳米基因载体的肿瘤主动靶向治疗，目前主要有两种载体表面靶向修饰的策略可被利用。第一种策略是将能与肿瘤细胞表面高表达受体结合的小分子化合物(如时酸)作为纳米载体的靶向性分子。第二种策略是通过特异性肿瘤细胞单克隆抗体完成纳米载体与细胞的定向结合。近年来，用能与肿瘤组织高亲和力结合的小分子肽(如RGD)作为靶分子进行药物靶向转运的成功经验，

3、已让我们看到了在此基础上发展第三种纳米载体靶向肿瘤策略的希望。为此，本文首先通过噬菌体展示肽库，筛选获得一批能够与肝癌细胞特异性结合的短肽，并鉴定它们与肝癌细胞的结合特异性。我们的研究为顿士学位论文中文摘要进一步研制用于治疗肝癌的靶向纳米基因载体奠定了初步的实验基础。第一章人肝癌细胞特异性结合短肽的筛选目的：通过噬菌体展示肽库，筛选人肝癌细胞结合短肽，验证它与肝癌细胞特异性结合的能力。方法：(1)以人正常肝细胞(L一02)为阴性消减细胞，人肝癌细胞(HepG2)为筛选靶细胞，对噬菌体随机七肽库(PHD-7TM)进行全细胞消减筛选。(2)体外筛选4轮

4、后，随机挑取50个阳性噬菌体克隆进行序列测定，并进行短肽序列的同源性分析。(3)以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性，排除假阳性或无差异结合的噬菌体。根据序列分析及ELISA鉴定的结果，选择其中～个具有较高亲合力的噬菌体克隆进行结合特异性的分析。结果：(1)经过4轮体外筛选，可见噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集。结果表明，回收噬菌体的滴度由第一轮的0．6x104pfh增加到第四轮的5．856x106pfu，增加了976倍；同时，回收率也显著提高，由第一轮的0．3x10。7增至第四轮的292．8xlff7。相对而言，对照细胞L-0

5、2的回收率则由第一轮的3．48xlff7降至第四轮的0．61xlff7。(2)以蓝白斑实验随机挑取50个携带噬菌体的大肠杆菌克隆，经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列(Sl～S50)，其中，编号为Sl的克隆重复14次，S4重复13次，S13重复8次，S8重复3次，S9、S14n硕士学位论文中文摘要各重复2次，$20出现1次，因而最终产生7条核苷酸序列，分别为Sl、S4、S13、S8、S9、S14、$20。根据氨基酸密码子，将上述插入序列翻译成氨基酸，即为噬菌体展示短肽一HCBP(HepatomaCellsBindingPeptide)。分别被命名

6、为HCBPl、HCBP4、HCBPl3、HCBP8、HCBP9、HCBPl4，HCBP20。经BLAST分析发现，在已知蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列完全一致或具有较好同源性的蛋白质分子。(3)酶联免疫分析(ELISA)鉴定显示，上述几个阳性克隆在HepG2细胞和L一02细胞上有差异性结合，其中S1噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大。结合测序分析，本文选择Sl噬菌体克隆做进一步鉴定。第二章HCBPI结合短肽特异性的鉴定目的：分析sl噬菌体克隆及人工合成短肽HCBPI与肝癌细胞结合的特异性。方法：(1)通过体外结合实验、免疫细胞化学染色，鉴定s

7、l噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性；通过免疫组织化学染色，鉴定Sl噬菌体克隆与人肝癌组织结合的特异性。(2)人工合成该噬菌体所呈现的短肽，采用竞争ELISA实验证明合成短肽对噬菌体与靶细胞结合的竞争性抑制作用。(3)利用免疫荧光技术观察人工合成肽HCBPl与肝癌细胞的结合特异性。结果：(1)体外结合实验、免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示，IlI顾士学位论文中文摘蛋S1噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞，并能与肝癌组织特异性结合。(2)竞争ELISA实验显示，Sl噬菌体克隆与HepG2细胞的结合能被其插入序列的人工合成肽HCBP

8、I竞争抑制。(3)免疫荧光显色证实，FITC．HCBPl能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞浆。结论：+(1)本实验获得