从噬菌体7肽库中筛选哇巴因特异性结合短肽并初步分析其生物学活性

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：徐瞻佛导师签名：徇细哝、学院领导签名：2哼蔼，司‘汐一分年j月岁，日研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的

2、研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：缛晦讳导师签名：红俪皎&-功缉3月乡，Et中文摘要从噬菌体7肽库中筛选哇巴因特异性结合短肽并初步分析其生物学活性摘要目的：从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽，并分析其生物学活性，为研究哇巴因与钠泵的相互作用及防治内源性哇巴因相关的原发性高血压奠定基础。方法：(1)哇巴因特异性结合短肽的筛选。①亲和筛选用哇巴因和卵清蛋白复合物包被酶标板，牛血清白蛋白封闭，快速洗板，加入稀释噬菌体文库，弃去未结合噬菌体，洗脱，收集洗脱液。将洗脱液加入大肠杆菌ER2738增殖培养。重复以上操作3次，获得高度富集的噬菌

3、体。②吸附实验用卵清蛋白包被酶标板，加入第3轮淘筛的噬菌体，收集未结合的噬菌体，测定滴度。重复3次后保存洗脱液。③滴度测定将3轮淘选产物与ER2738混合接种于IPTG．Xgal培养板上。计数培养板上的蓝斑。@ELISA法鉴定用哇巴因与卵清蛋白复合物包被ELISA板的各孔，依次加入第3轮扩增后噬菌体、抗M13抗体和底物溶液H20z，酶标仪测以。。值。⑤噬菌体阳性克隆ssDNA的提取及测序分析，并推导出短肽序列，合成多肽。⑥同源性分析：应用NCBUBLAST数据库，比较推导出的氨基酸序列同已知蛋白质的同源性。(2)哇巴因结合肽生物学活性的检测。①采用放射性核素标记法测定3H一哇巴因与

4、哇巴因结合肽的结合活性。②MTT比色法检测哇巴因结合肽对哇巴因所致血管内皮细胞EAhy926生长抑制的影响。⑧形态学观察：倒置光显微镜观中文摘要察细胞形态结构改变；Hoechst33342／PI双荧光染色，荧光显微镜观察细胞死亡特征。④半定量RT-PCR法检测畦巴因结合肽对哇巴因所致钠泵Q1亚单位、pl亚单位、Ⅶ．cadherin和SnailmRNA表达改变的影响。结果：(1)从噬菌体7肽库中筛选出与卵清蛋白．哇巴因藕联物特异性结合肽的效率：第1轮：2．0×10门％，第2轮：2．1×10。3％，第3轮：3．8％。使与卵清蛋白．哇巴因藕联物特异性结合肽得到高度富集。2×1013pfu

5、／ml的噬菌体库经过3轮卵清蛋白包板吸附实验，特异地与哇巴因结合的噬菌体库为1．8×102pfu／ml，经过3轮淘选并经ELISA鉴定，从噬菌体随机7肽库中筛选得到14个阳性克隆，对其ssDNA进行测序分析。筛选出3种多肽：肽A的筛选一致率达到64．3％(9／14)，共有碱基序列：CAACGTACTGGACGTCCACT，蛋白序列：RCMTSRS，同源蛋白：一种多蛋白复合体，位于其643—648位置，主要参与细胞的多种信号传递；肽B的筛选一致率为28．6％(4／14)，共有碱基序列：GAGCGTTGGTGCATGGTGTG，蛋白序列：LATTVPH，同源蛋白：氨甲酰天冬氨酸脱水酶，

6、位于其26．32位置；肽C的筛选一致率为7．14％(1／14)，共有碱基序列：TGCGTGTGn汀GGATGG，蛋白序列：TATTIPT，同源蛋白：一种假象蛋白，位于其248．252位置。(2)放射配基实验结果：哇巴因结合肽能与3H．哇巴因结合，其回归方程：B／F=．0．743B+94．5276(r=一0．768)，Kd'-0．836nmol／L，Bm。x=127．7fmol／mg蛋白。结果表明，3H．哇巴因与哇巴因结合肽(OCP)结合的平衡解离常数为0．836nmol／L，受体密度为127．7fi-nol／mg。(3)哇巴因可抑制EAhy926细胞生长，且呈浓度一时间依赖性；高浓

7、度畦巴因(10／嘭mol／L)中文摘要对细胞有剧烈抑制作用，而低浓度(O．00I／Mmol／L)对细胞增殖的抑制作用明显降低。经直线回归计算24h、48h、72hIC50值分别为0．507、0．126、0．038gmol／L。(4)哇巴因结合肽拮抗作用：哇巴因结合肽可拮抗哇巴因对EAhy926细胞抑制生长作用，且呈浓度一时间依赖性；高浓度哇巴因结合肽(100／比mol／L)对细胞有较强保护作用，而低浓度(0．001pmol／L)对细胞的保护作用则明显降低。经直线回归计