噬菌体随机12肽库中vegf模拟表位的筛选及初步

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1、噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步【摘要】目的：从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF）mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽.方法：用Avastin为靶分子，对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗，随机挑取80个克隆，ELISA法鉴定其亲和性，将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定，推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列.Fmoc固相法合成12肽，戊二醛交联12肽与血蓝蛋白（KLH），打点印迹（Dotblot）检测偶联物能否与Avastin结合.结果：ELISA显示，42个噬菌体克隆与Avastin有较强的亲和性，测序发现41个阳

2、性克隆表达的融合12肽的序列一致，1个不同；化学合成的12肽能与Avastin特异性结合，12肽KLH偶联物也能与Avastin特异性结合.结论：初步证明12肽模拟了VEGF部分表位.【关键词】Avastin(bevacizumab)细菌噬菌体肽库血管内皮生长因子交联　0引言　　血管生成是肿瘤生长和转移的前提［1］.血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管形成过程中的关键因子［2-3］.肿瘤组织中VEGF表达水平与肿瘤血管化的程度、恶性程度呈正相关［4-5］.因此，VEGF是肿瘤抗血管生成治疗中比较理想的靶分子.噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表

3、位的模拟肽，运用肽库筛选时不需要靶蛋白的任何结构，只需靶抗原的mAb就可以获得具有免疫原性和抗原性的多肽，它们反映了抗原结合位点的特定的构像［6-7］.我们利用抗VEGFmAb阿瓦斯汀（Avastin）对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选，旨在筛选出能与Avastin有高亲和力的噬菌体克隆，并分析其展示的多肽序列能否模拟VEGF的表位.　　1材料和方法　　1.1材料抗VEGFmAbAvastin(罗氏公司)；噬菌体随机12肽库（新英格兰生物公司）；PEG8000（华美生物公司）；IPTG,XGal、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗噬菌体单克隆羊抗体(HRPantiM1

4、3，皮尔斯生物技术公司）；血蓝蛋白（KLH，西格玛公司）.550型ELISA读数仪（美国伯乐公司）.　　1.2方法　　1.2.1VEGF模拟表位肽的筛选　　1.2.1.1噬菌体库的生物淘洗用100g/LAvastin150μL包被96孔板的1个孔，4℃过夜，封闭后加入100μLTBST稀释10μL12肽库，室温作用1h，用1ml/LTBST冲洗10次.加入洗脱液(0.2mol/LGlycineHCl,1g/LBSA)100μL作用8min，吸出洗脱液，再用1mol/LTrisHCl15μL中和上述洗脱液.吸取1μL洗脱液测定滴度，其余液体加入20mLLB培养基（含E

5、R2738200μL，四环素贮液20μL）进行扩增和纯化.按以上步骤进行第2,3轮筛选，但分别用3，5mL/LTBST洗涤.　　1.2.1.2阳性噬菌体的鉴定第3轮筛选完成后，挑选80个分割良好的噬菌体克隆分别进行扩增和纯化.将纯化好的噬菌体分别加入预先包被了Avastin和人IL15mAb（阴性对照）的96孔板中，室温作用1h；加入HRP标记的抗M13（1∶2000）抗体，作用1h.OPD显色，测定A490nm值，以A490nm值高于阴性对照2.1倍作为阳性克隆.　　1.2.1.3阳性噬菌体与Avastin结合的剂量依赖实验以5mg/LAvastin包被96孔板,每

6、孔100μL，同时对每个Avastin包被孔设立IL15mAb的包被孔为阴性对照，4℃孵育过夜.加入封闭液（5mg/LBSA,0.1mol/LNaHCO3,pH8.6），4℃封闭2h，将阳性噬菌体稀释至5×1014pfu/L后作倍比稀释（pfu：噬菌斑形成单位），直至其滴度为1.9×1010pfu/L，分别加入Avastin及IL15mAb包被孔，100μL/孔，室温孵育2h，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb（1∶5000）100μL，室温孵育1h，OPD显色后测定A490nm值.　　1.2.1.4阳性噬菌体单链DNA的提取及测序取500μL上述噬菌体贮

7、液，加入200μLPEG8000/NaCl放置10min，离心10min，弃上清，沉淀重悬于100μL碘化物缓冲液中，加入250μL乙醇，室温作用100min，离心100min，弃上清，用700mL/L乙醇洗沉淀，短暂真空干燥.沉淀重悬于30μLTE(0.01mol/LTrisHCl，1mmol/LEDTA)中，取上述溶液5μL送上海生工生物公司测序.　　1.2.2人工合成12肽与Avastin结合的剂量依赖实验将不同稀释度的合成12肽加入对应的孔中（初始浓度为16g/L，倍比稀释至终浓度为0.25g/L），每孔100μL,4℃过夜；封