利用噬菌体12肽库筛选针对鸡ibdv单抗的模拟表位

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1、安徽农业大学硕士学位论文利用噬菌体12肽库筛选针对鸡IBDV单抗的模拟表位姓名：李向红申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：余为一201205摘要m㈣0咖Ⅲm㈣㈣Ⅲ㈣mIY2149984由传染性法氏囊炎病毒(Infectiousbursaldiseasevims，IBDV)引起的IBD是鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害3．12周龄雏鸡或青年鸡的中枢免疫器官法氏囊，严重感染可导致发病鸡死亡；存活鸡则由于法氏囊损伤而造成全身性免疫抑制，结果因免疫能力下降，易感染其他传染病。该病呈世界性分布，是危害禽类养殖的三大疫病之一。目前

2、还没有特效的药物治疗此病，因此IBDV高效疫苗的研究变得刻不容缓，IBDV抗原表位的确立有助于表位疫苗的研究。研究表明，IBDv属双RNA病毒科(Bimaviridaefamilv)的双RNA病毒属(Avanbimavirus)。基因组包括A和B两个片段。A片段编码VP2．4．3和VP5组成的多聚蛋白；其中VP2和VP3为主要结构蛋白，VP4为病毒自身蛋白酶，而VP5只能在IBDV感染的细胞中被检测。B片段编码VPl蛋白，为RNA依赖的RNA聚合酶。迄今，在IBDV的VP2及VP3上发现多个抗原表位序列。本研究利用噬菌体肽库对实验室保存的3株

3、IBDV单克隆抗体(H53、V1和V38)进行生物淘选，淘选出与IBDV单克隆抗体特异性结合的噬菌体株，进而通过ELISA筛选出能与IBDV竞争性结合IBDV单克隆抗体的噬菌体株，测序分析其序列后获得IBDV的抗原表位。具体操作如下：首先：将实验室保存的3株IBDV单克隆抗体(H53、V1和v38)细胞株进行复苏培养，3株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：256、l：64和1：128。3株杂交瘤细胞分别注射8周龄的Balb／c小鼠腹腔制备腹水，ELISA测定腹水效价分别达1：2×105，3×104，1×105以上。H53，V1和V38的亚类鉴定

4、均为IgG2b。采用辛酸．饱和硫酸铵法对3株单克隆抗体提纯，纯化后的单克隆抗体经SDS．PAGE出现2条带，分别为IgG的轻链与重链。应用凝胶分析软件对蛋白质条带进行光密度扫描，三株单克隆抗体的纯度分别为99．5％，98．6％和99．1％。通过间接ELISA测定样品效价，达1．6×104。经处理的单克隆抗体具有较高的纯度和活性，能够保证亲和筛选过程中与噬菌体的特异性结合。其次，利用噬菌体随机12肽库对单克隆抗体H53、V1、V38进行4轮淘选，通过逐轮降低包被浓度及增加洗脱时间来提高单克隆抗体与噬菌体的特异性结合。随机挑取30个噬菌体克隆，通

5、过噬菌体ELISA鉴定后获得22个阳性噬菌体克隆；进一步用竞争ELISA获得14个噬菌体株能抑制单克隆抗体与IBDV的结合，其抑制率达50％以上。最后，测定14株噬菌体单克隆序列。通过DNAstar软件分析12肽序列，比对找出共有序列。总之，本研究通过噬菌体12肽库筛选IBDV单克隆抗体，成功鉴定出3个抗原模拟表位，即H53识别的抗原模拟表位为XILRXX)C-。(XHM，V1识别的抗原模拟表位为RXLRLXXPIXQX，V38识别的抗原模拟表位为X砌()(R麟对心RP(X为任意氨基酸)。本实验获得的IBDV抗原表位序列为鸡法氏囊病的致病机理

6、及高效疫苗的研究提供依据，对于IBD的防控具有重要意义。关键词：传染性法氏囊病毒，单克隆抗体，噬菌体展示，模拟表位AbstractInfectiousbursaldiseaseVims(IBDV)isthecausatiVeagentofinfectiousbursaldisease(IBD)andresultsinahighlycontagiousandimmunosuppressiVedisease．IBDVmainlydod锄agetotheyoungchickenabout3—12weeks，italsocanleadtothedea

7、thoftheinfectionschicken．DuetothesystemicimmunosuppressionofthesulWiValofchicken，theyhaVeaweakenedimmunesystemandeasytoinfectedwithotherdisease．IBDVisoneofthet11reeepidemicsagainstthepoultryindustryanddistributionworldwide．Thereisnomagicdmgtotreatthediseaseforthepresent，iti

8、sinstanttoexploretheIBDVe锸cientVaccine．EstablishingtheepitopesoftheIBDVwillcontrib