利用噬菌体12肽库筛选生长抑素抗原模拟表位

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1、利用噬苗体12肚库筛选生长抑素的抗原模拟表位摘要生长抑素(Somatostatin，SS)是由下丘脑分泌的一种含14个氨基酸残基的短肽类激素，其主要生理作用是抑制生长激素的分泌。本研究主要工作及结果如下：1．构建了pET-32a-ss表达质粒，转化大肠杆菌BL21(BE3)，用IPTG进行诱导表达，SDS．PAGE检测表明，SS基因在大肠杆菌中实现了融合表达，蛋白分子量约为23．4KD。2．用疫苗“激生l号”免疫日本大耳兔获得抗生长抑素血清，饱和硫酸铵粗提IgG，再经DEAE-sephadex．A50低压层析系统纯化IgO，最后用SDS．聚丙烯酰胺凝胶电

2、泳检测其纯度，并用放射免疫法检测Ss抗体的含量。以纯化后的SSIgG作为筛选配基，用蛋白竞争洗脱法结合阴性血清吸附的方法，对噬菌体随机12肽库进行了四轮淘洗，随机挑取22个蓝色噬菌斑扩增后，用EUSA初步鉴定，发现有6个噬菌斑克隆与SS抗体有较强的特异性结合，通过进一步的竞争抑制ELISA，仍有较好的抑制效果。将该6个阳性克隆提取ssDNA进行测序与分析，结果中有5个阳性克隆的外源肽序列完全一致，与SS氨基酸序列进行比对，得到同源序列FWK．关键词：生长抑素；克隆与表达；噬菌体展示技术；模拟表位华中农业大学2006届硕士学位论文Abs仃actSomato

3、statinisapeptidehormonehavingfourteenaminoacidsecretedfromhypothalamus．Themainphysiologicalactionofsomatostatinisinhibitsecretingofgrowthhormone．Theresultsofthisexperimentaresummarizedasfollowing：1．AprokaryoticexpressingplamidpET-32a-sswasconstructedandexpressedinE．coliBL21(DE3)．

4、AfterinducedbyIPTC‘allexpressiedproteinwasobtainedandit’smolecularweightwasapproximately23．4KDbySDS-PAGE．2．Thespecificserawereobtainedbyimmunizingrabbitswithsomatostatinvaccine．Afterpurifiedwithsaturatedammoniasulphate，theIgOwaspurifiedthroughDEAE-sephadex-A50lowpressurechromatog

5、raphysystem．TheIgGwastestedbySDS-PAGEandit’scontentwasmeasuredusingradioimmunoassay．ThentheIgOwasusedastarget,toscreenthephagedisplay12一merrandompeptideslibraryfor4roundsbycompetitiveelutionandabsorptionwithnegativesera．22cloneselutedfromthe4rdpanningwerepickedoutrandomlyandchara

6、cterized．Sixpositiveclonesamong22cloneswereidentifitedbyELISAandcompetitiveELISA．ThessDNAofthe6positivecloneswereabstractedandsequenced．Theresultsshowedthatfiveclonesofthemhadthesamesequence．Comparedwithsomatostatinaminoacidsequence．thehomogeroussequencewasFWICKeywords：somatostat

7、in；cloningandexpression；techologyofphagedisplay；mimotope利用噬苗体12肚库筛选生长抑素的抗原模拟表位缩写SS船SSRHbsAgTween-20AmpBis啊Sbasebp(s)dddH20DTTEDTAgh【gGIPTGKbkDakgLBmgmInmLoDOfIPAGEELISAPBSr／minRESDSSeCSKLTETEⅣ哐DX-gal鹏皿岫DEAE·SephadexA一50TnBSA缩略语表(Abbreviations)英文名称somatostatinsomatostaingenesomato

8、statinreceptorhepatitisBsurfaceantigenTw