应用噬菌体随机肽库筛选阴道毛滴虫特异性b细胞表位

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1、万方数据AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterScreeningSpecificB—cellEpitopesofTrichomonasvaginalisbyPhageRandomPeptideLibraryBySenYangSupervisor：Prof．ChangguiXuePathogenBiologyBasicMedicalCollegeMay,2014万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文

2、中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：≯千年6月l目学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本

3、人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：卅魑日期：Wcr年6月f日万方数据摘要应用髓体随机肽库筛选阴道毛滴虫特异性B细胞表位硕士研究生杨森导师薛长贵教授郑州大学基础医学院寄生虫学教研室(郑州450001)摘要背景与目的阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis，Donne1837)，是一种主要寄生于人体泌尿生殖道的鞭毛虫，它所引起的阴道毛滴虫病是常见的性传播疾病之一，据WHO统计，全球每年约有1．8亿人感染阴道毛滴虫，同时阴道毛滴虫的

4、广泛流行还增加了HIV病毒和支原体的感染率。目前对于阴道毛滴虫病的快速诊断方法的灵敏度及特异度有限，阴道毛滴虫疫苗的研发工作也相对滞后。本研究运用分子生物学、免疫学和生物信息学的方法技术，运用噬菌体随机7肽库淘选阴道毛滴虫的特异性B细胞表位，并对淘选结果进行免疫原性，敏感性及特异性检测，旨在为阴道毛滴虫病的快速诊断方法及未来疫苗的研发提供理论基础。材料与方法1．将采集到的阴道毛滴虫临床分离株(取自于郑州大学第五附属医院检验科)接种于TYM培养基进行连续培养，达到纯培养后将虫体分别制作为全虫抗原和冻存。2．将全虫抗原经背部皮下多点注射免疫实验用

5、兔(购自于河南省实验动物万方数据摘要中心)，每隔2W加强免疫2次，末次免疫后ELISA检测抗体效价，达标后采集、分离并纯化免疫血清，并进一步经Western．Blot和间接免疫荧光检测其免疫原性。3．以纯化后兔抗阴道毛滴虫IgG对噬菌体随机7肽库(购自于美国NEB公司)进行3轮的亲和淘选，ELISA检测淘选结果，并将阳性噬菌体克隆送往生物公司进行测序，将测序结果分别与Genbank上的阴道毛滴虫已知蛋白序列进行比对，并在Protscale在线服务器进行相关生物信息学分析。4．将选取的阳性噬菌体克隆经背部皮下多点注射免疫BALB／c小鼠(购自于

6、河南省实验动物中心)，并同时设立阳性对照、阴性对照及溶剂对照，每隔7d免疫1次，共免疫3次。末次免疫后采集并分离免疫血清，进行ELISA和Western．Blot检测免疫原性，并通过间接免疫荧光试验研究阳性噬菌体展示肽的虫体定位。5．建立阴道毛滴虫小鼠皮下感染模型，每日观察脓肿形成情况及脓液中活虫的数量。以感染血清通过ELISA的方法检测阳性噬菌体克隆的敏感性及特异性。6．ELISA检测阳性噬菌体表位肽免疫小鼠血清中细胞因子IL．4和IFN吖的水平。争士旦皇日木1．阴道毛滴虫在48h左右达到最高生长密度，36～48h为其对数生长期，连续培养3

7、代后即达到纯培养。SDS．PAGE结果表明全虫抗原的蛋白条带分布在10～150kDa之间，其中30～70kDa之间的蛋白条带最为密集。2．ELISA检测的结果显示阴道毛滴虫全虫抗原经免疫实验用兔后可引起较强的免疫反应，产生的抗体滴度大于1：106。Western．Blot发现共有15条的全虫抗原的蛋白成分可被兔免疫血清识别，比小鼠免疫血清多出3条。免疫荧光染色的结果表明虫体可与全虫抗原的兔免疫血清发生免疫反应，呈现红色荧光。3．经过3轮的亲和淘选，共得到14个阳性噬菌体克隆，P1-P14。P1～P14与Genbank上己知的阴道毛滴虫蛋白序列

8、无一级结构的相似性。综合噬菌体ELISA及Protscale在线服务器的生物信息学分析结果，P3、P5和P11的免疫原TT万方数据摘要性相对较强。4．ELISA结果