从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌b型肠毒素抑制剂

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1、从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂作者：李韩平，周宏，郑玉玲，邓小红，马茹，姜永强【关键词】葡萄球菌B型肠毒素ScreeninginhibitorofStaphylococcalenterotoxinBfromrandomcircular7merpeptidelibrarydisplayedonphage　　【Abstract】AIM:Toobtainthespecificpeptidetherandomcircular7merpolypeptidelibraries.METHODS:Theaffinityofpeptideandth

2、epetitiveactivityofthesyntheticpeptideonoclonalantibody(McAb)alexperimentedtoassessthesuppressiveeffectofthescreenedpeptideonthetoxicityofSEBanditsenterotoxin.RESULTS:Thecircular7merpeptideobtainedbypanningsuppressedthemultiplicationofspleenlymphocytesinmice.Attheratioof160:1(SEB:s

3、ynthetic7merspeptide),thepeptideprotectedthelittlecatsfromattackofenterotoxinandthesurvivalrateofmicetreatedentofSEBinhibitors.　　【KeyAb竞争结合SEB的情况；通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况.结果：筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活；合成肽与SEB质量比160∶1下，合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性，并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用.结论：得到了能与SEB特异结

4、合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽.　　【关键词】葡萄球菌B型肠毒素；肽库;筛选;抑制剂　　0引言　　　　葡萄球菌B型肠毒素(StaphylococcalenterotoxinB,SEB)［1］是超抗原(SAg)家族的主要成员之一，该毒素可以造成食物中毒，严重时甚至导致致死性休克.SEB中毒后缺乏特异的治疗手段，因此研究SEB的特异高效抑制剂具有重大的意义.我们利用固相筛选方法，即以SEB作为亲和靶标蛋白，从环状7mer肽噬菌体文库中筛选到与SEB结合，并能抑制该毒素毒性效应的噬菌体克隆.结果表明，所筛选环状7mer肽在细胞水平上可抑制SEB对小鼠脾

5、细胞的激活，在整体动物水平上对SEB导致的毒性具有一定保护作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　环状7mer肽噬菌体文库(Randomcircular7merspeptidelibrarydisplayedonphage)为Nea产品；抗M13噬菌体mAb、CMSepharoseFF为Amesham产品;BCA蛋白定量试剂为Pierce产品.乳猫BALB/C实验动物由军事医学科学院丰台实验中心提供并饲养.　　1.2方法　　随机肽库的扩增、定量按照所附试剂盒说明书进行；纯化按QIAprepM13Handbook进行.亲和靶标蛋白SEB的分离纯化与定量按　　统

6、计学处理：应用SPSS统计软件，利用单样本t检验对单克隆原种亲和性进行分析,合成肽对小鼠的保护抑制利用成组设计多样本比较的秩和检验进行分析，以P<0.05为有统计学差异.2结果将本室重组表达的蛋白进行CMFF离子交换层析.纯化产物进行SDSPAGE分析，可获得高纯度的SEB(Fig1),为证明噬菌体肽库淘选的有效性，即有富集现象出现，需计算每轮淘选产量，每次加入噬菌体数固定.通过3轮淘选发现，随着淘选次数的增加，出现了富集，噬菌体环状7肽肽库第3轮比第一轮的产量高出1.375倍.经过3轮亲和筛选，随机挑选14个分隔良好的单克隆制备原种，进行PhageE

7、LISA鉴定，以高出阴性对照5倍的单克隆作为阳性克隆,结果如Fig2，其中15为阴性对照.对噬菌体单克隆原种A450进行单样本t检验，t0.05/2（13）=2.160＜t=10.85,P＜0.05，相对于阴性对照A450，噬菌体单克隆原种A450具有显著性差异.从以上结果可以看出，经过3轮筛选噬菌体得到了明显富集，可见亲和筛选的方法是有效的，已得到与SEB特异结合的短肽.选取10个阳性克隆进行测序，推导出相应的氨基酸序列.即为噬菌体外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合展示的环状7肽.通过筛选得到的阳性克隆序列具有很好的一致性，均为CLPRQSSFC.　　2结果　　

8、2.1合成肽对SEB超抗原作用的体外抑制活性合成多肽