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《乳腺癌抗hEGF单链抗体的筛选和活性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、780ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2010,26(8)论著文章编号:1007-8738(2010)08-0780-03乳腺癌抗hEGF单链抗体的筛选和活性鉴定121113111吕勇刚,史明,常鹏,王廷,李南林,赵爱志,凌瑞,王岭(第四军医大学西京医院:血管内分23泌外科,神经内科,陕西西安710032;中国医学科学院基础医学研究所免疫室,北京100005)[摘要]目的:从噬菌体单链抗体库筛选特异性的抗人表皮基康公司合成。生长因子(hEGF)
2、抗体并进行活性鉴定。方法:以hEGF为抗1.2方法原,对所建抗体库进行3轮吸附洗脱扩增!的亲和筛选。1.2.1噬菌体抗体库的复苏和准备乳腺癌单链抗体库为将筛选后的单链抗体(scFv)通过ELISA和基因测序分析等方9我们自行构建,-80#冻存,初级库库容为1∀10。将10mL法进行鉴定;利用MTT法在体外培养的人乳腺癌细胞系噬菌体抗体库接种于1000mL2YT培养液。振摇至A600=MCF7/Her2+中检测抗体的生物结合活性。结果:在亲和筛100.6,按照大于一个数量级取样(TG1菌量约3∀10),
3、用辅选过程中,乳腺癌噬菌体scFv得到富集,收获率逐轮得到提助噬菌体M13K07进行挽救(滴度为1∀1015/L),使其表面呈高,3轮筛选之后,得到了3株高亲和力的抗hEGF抗体;现。收集获得感染能力的噬菌体,用PEG/NaCl将其沉淀重ELISA检测筛选出的3种有较高活性;测序结果与人hEGF抗悬于10mLPBS中,测定滴度。然后按照200∃1的比例感染+体基因序列高度一致;该抗体对MCF7/Her2乳腺癌细胞系大肠杆菌BS1365(Cre+,A=0.6,100mL),进行细胞内重600有特异性杀伤作用。结论:
4、成功地筛选到特异性抗hEGF的组。振摇过夜后再次加入M13K07进行挽救,取菌液离心,scFv抗体,为今后的研究和应用提供依据。11收集上清,以%1∃1的比例,用3∀10的噬菌体再次感染表[关键词]噬菌体抗体库;乳腺肿瘤;单链抗体;抗人表皮生达Cre重组酶的菌株TG1,以实现基因型和表现型的一一对长因子应。以20∃1的比例再次加入M13K07,获得噬菌体抗体,常[中图分类号]R392.11[文献标识码]B17规PEG沉淀,调整滴度为1∀10cfu/L备用。1.2.2抗hEGF抗体的筛选hEGF用碳酸盐Bu
5、ffer稀释至当前,开发具有靶向治疗作用的抗体是乳腺癌100mg/L,以1mL包被免疫管,4#过夜,次日加入25g/L领域的研究热点,第1个单克隆抗体(mAb)药物赫脱脂奶粉封闭2h,加入1mL噬菌体抗体库(约含噬菌体赛汀,即抗人表皮生长因子(humanepidermalgrowth131∀10cfu),室温孵育2h,用含0.05mL/LTween20的PBSfactor,hEGF,Her2)抗体已于1998年经FDA批准上洗10次(第2轮开始洗20次以上),加入1mL对数生长期的市,可作为单个药或与化疗药物联
6、合治疗Her2阳性的TG1,37#孵育20min。吸附于hEGF的噬菌体抗体感染TG1。原发或转移性乳腺癌,为乳腺癌治疗带来了新的希为保护弱势菌群,将其平铺于含有葡萄糖和氨苄的2YT平板,[1]30#过夜。次日用2mL培养液刮取菌落,扩大培养后同上,望。赫赛汀是一种重组DNA衍生的人源化mAb。获取噬菌体,加入辅助噬菌体M13K07,使其感染BS1365,进有没有手段直接获得人源性的抗hEGF抗体基因呢?[2]行细胞内重组,得到次级库,测定滴度。如此反复,共进行我们前期利用loxcre系统和T载体过渡的方法,成3
7、轮。功构建乳腺癌大容量全人源单链抗体库。初级库库容1.2.3可溶性抗体的表达与鉴定(1)可溶性抗体的表达:911[3-4]量为2.5∀10,次级库库容量为2.5∀10。本研噬菌体抗体感染大肠杆菌HB2151(非抑制型菌株,scFv基因究我们旨在从该抗体库中筛选抗hEGF抗体,并对筛片段与噬菌体g3p序列之间有琥珀终止密码子TAG,该密码选到的抗体进行活性鉴定。被识别实现scFv的可溶性型表达),37#孵育15min,涂培养板。挑单阳性克隆在含有氨苄的2YT培养液振摇过夜,次日1材料和方法取50L细菌到1mL
8、2YT培养液,37#振摇至对数生长期,1.1材料表达载体噬菌粒pDAN5、大肠杆菌TG1、加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导,30#培养过夜,收取+BS1365、HB2151,Her2阳性的乳腺癌细胞系MCF7/Her2、上清即得到可溶性抗体。(2)ELISA法鉴定:将hEGF抗原稀辅助噬菌体M13K07由本室保存。hEGF为Sigma公司产品,
