肺表面活性蛋白A适配体的筛选与鉴定.pdf

《肺表面活性蛋白A适配体的筛选与鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2013年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1659～1663DOI-10．3724／SP．J．1096．2013．30461肺表面活性蛋白A适配体的筛选与鉴定刘利娟陈怡王伟陈超高明吴张晓青张娟琨(天津科技大学生物工程学院，教育部工业微生物重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津300457)摘要利用指数式富集的配基系统进化(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment

2、，SELEX)技术筛选肺表面活性蛋白A(PulmonarySurfactantProteinA，SPA)的寡核苷酸适配体。通过对循环次数、退火温度及引物比例的优化，建立了适合的筛选体系；筛选产物经克隆测序后，用DNAMAN软件初步分析其结构。最终确定以12个循环，55℃为退火温度及80：1为引物比的反应条件；经过9轮循环筛选，随机ssDNA库与sP—A的结合率从1．3％上升到33％；AP一3和AP-2适配体的随机区含有保守序列TAC—GT，AP一3和AP一1适配体的随机区含有保守序列ACAG，且各适配体的二级结构均以茎一环结构为

3、主。关键词肺表面活性蛋白A；指数式富集的配基系统进化；寡核苷酸适配子1引言SP—A是一种多功能糖蛋白，在调节肺表面活性物质(PS)代谢、基因表达、肺内免疫及炎症反应方面具有重要作用。sP—A主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞中合成，在肺外表达量很少，在肺内则为高浓度表达，表现为肺特异性。。。SP—A分子量为28～36kDa，等电点为4．65．5。在肺泡中，SP—A一般多以三聚体形式存在，人sP．A三聚体是由2个sP．A分子和1个sP—A分子组成的。天然的sP．A由6个三聚体单元组成并形成花束状”结构。其表达水平的高低与临床某些肺部疾病直接相

4、关，是某些肺部疾病的特异性诊断和判断预后的指标。很多肺部疾病在早期依据临床表现、x线征象以及一些创伤性检查，难以早期诊断评价肺泡一毛细血管屏障损伤程度。近年来很多实验表明，血清SP—A是反映肺功能障碍和血气屏障损伤敏感而可靠的指标_9j。当疾病导致肺部损伤后，肺内sP—A可通过损伤的肺泡一毛细血管膜屏障进入血液循环而成为肺损伤的血清标志物。血清中sP—A的量和肺损伤程度密切相关，肺部损伤越重血清中sP—A浓度就越高，检测患者血循环中sP—A水平可以判断肺损伤程度，预测疾病转归情况。Lykke等¨综述了人血清中SP—A水平与肺部疾

5、病的关系；Nskae等报道了血清SP—A水平可作为诊断急性呼吸窘迫综合症的良好指标；Goto等确定了sP—A在非感染性急性肺损伤的研究中起着保护作用。目前检测sP．A的常用方法是酶联免疫分析(ELISA)法，制备抗体周期长、成本高，并且抗体易失活。指数式富集的配基系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术，应用大容量的随机寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合寡核苷酸，经几轮或数轮的筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配体。目前，该技术已成功应用于许多靶物质的筛选，包括蛋白、小分子、金属离子_l

6、，甚至病毒、细菌、细胞等一些复杂靶标，部分核酸适配体已进入临床试验阶段。本研究以sP—A蛋白为靶分子，利用SELEX技术从随机ssDNA文库筛选sP—A特异结合的寡核苷酸适配体，并对所筛选出的适配体结构进行了初步分析，为进一步快速检测肺部疾病奠定了基础。2实验方法2．1仪器与试剂PCR仪(美国Bio．Rad公司)，DYY．8C型电泳仪、DYCZ-24D型电泳槽(北京市六一仪器厂)，UVP凝胶成像系统(PerRmElmerInstrumentsLambola3．5)，uV．2550紫外分光光度计(日本岛津科技有限公2013-05—

7、16收稿；2013-08-08接受本文系天津市科委项目(No．12ZXCXSY07500)，天津市滨海新区科委项目(No．2012一XJR21047)，科技部项目(No．12C26211600515)资助}E—mail：zhangjk@tust．edu．Cl1660分析化学第41卷司)，恒温培养箱(上海智城分析仪器有限公司)。SP—ABSATaqDNA聚酶DNA提取试剂盒北京鼎国生物有限公司；PuC18载体大肠杆菌JM109为本实验室保存；其它试剂为国产分析纯。随机ssDNA文库：5一CGGGAA1TrcTATGGCGGATGG

8、GAGCAGCGA(N19)GCCGCAAGAAAAAGTTYGAGAGCAAGC33"CCG一3，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列。上游引物：5．CGGGAAYrcTATGGCGGATGGGAGCAGCGA-3；下游引物：5．CGGAAGCTFGCTC