鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法的改良及鉴定.doc

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1、鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法的改良及鉴定【摘要】目的：提取及纯化SD大鼠肺灌洗液中表面活性物质结合蛋白D（SP-D）。方法：取SD大鼠肺泡灌洗液，经TrisHClEDTA法提取和maltoseagarose亲和层析法纯化SPD，用SDSPAGE电泳及SPD与幽门螺杆菌的玻片凝集试验鉴定。结果：从SD大鼠肺灌洗液中提取出较高浓度的蛋白，经SDSPAGE电泳检测，分子量约43kD，提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论：采用maltoseagarose亲和层析法可以从SD大鼠肺灌洗液中获得较高纯度的SPD。【关键词】肺泡表面活性物质相关蛋白

2、质D；大鼠，SpragueDawley；组织提取物；方法；生物学鉴定法　　［Abstract］Objective:ToisolateandpurifysurfactantproteinD(SPD)fromSDratbronchoalveolarlavageliquid.Metheds:SPDwereelutedfrombronchoaveolarlavagefluidofSDmicewithTrisHClEDTA,purifiedbymaltoseagaroseaffinitychromatography,andthendeterminedbySDSp

3、olyacrylamidegelelectrophresis(SDSPAGE)andagglutinationtestwithHelicobacterpylori.Results:SPDwithhighconcentrationwasobtainedbymaltoseagaroseaffinitychromatography.ThemolecularweightoftheobtainedSPDwas43kDa.Helicobacterpyloricouldbeagglutinatedbytheprotein.Conclusion:HighlypureSP

4、DcouldbeobtainedfromSDratbronchoalveolarlavageliquidbyaffinitychromatographyonmaltoseagarose.　　［Keywords］PulmonarysurfactantassociatedproteinsD；rats,SpragueDawley;tissueextracts;methods;biologicalassay肺表面活性物质结合蛋白D（SurfactantproteinD,SPD）是肺泡表面活性物质（PS）的重要蛋白成分之一[1]，在调节表面活性磷脂代谢和肺防御功能方

5、面起重要作用[2]，临床上应用合成的肺表面活性物质治疗呼吸窘迫综合征、胎粪吸入综合征等肺部疾病[3]。1989年PerssonA等[4]通过高效液相色谱法，采用硫酸镁吸附，柠檬酸钠洗提获得SPD，随着对其结构的深入研究，提取方法不断改进，1998年StrongP等[5]采用maltoseagarose亲和层析及Superose6凝胶过滤，提取到了高纯度的SPD。但由于Superose6柱价格昂贵，使该方法的应用受到限制。综合国外文献，删去Superose6柱的提取步骤，将洗提液进行调整，从SD大鼠肺泡灌洗液中进行SPD提取，并通过SDSPAGE电泳

6、和与幽门螺杆菌的凝集反应对其性质进行了鉴定，报道如下。　　1材料与方法4　　1.1实验动物及主要试剂　　SD大鼠（贵阳医学院实验动物中心）。maltoseagarose(sigma)，蛋白分子量标准，EDTA，叠氮钠，Tris，盐酸，CaCl2，甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED及考马司亮蓝等。幽门螺杆菌NCTC11637，获赠于中国疾病预防控制中心。　　1.2方法　　1.2.1鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的获取　　取清洁级SD大鼠9只，腹腔内注射20％乌拉坦0.5ml/100g，处死动物，固定、无菌操作分离出鼠肺，行气管插管后，用注射器注

7、入15ml无菌生理盐水，轻拍双侧肺部，然后回收获取BALF。　　1.2.2SPD的提取　　将BALF配制成20mmol/LTrisHCl和10mmol/LEDTA，调节pH值为7.4，室温下搅拌1h，在4℃下10000g离心40min，取上清液配制成20mmol/LCaCl2，重调pH至7.4，得SPD粗提物。　　1.2.3SPD的纯化　　将1mlmaltoseagarose加入2ml无菌注射器（注射器内先放一张滤纸片），制成层析柱，用含有10mmol/LCaCl2，0.02％（W/V）叠氮钠，20mmol/LTrisHClpH7.4的平衡缓冲液平衡层析柱

8、。将SP