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1、鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法改良及鉴定【摘要】目的：提取及纯化SD大鼠肺灌洗液中表面活性物质结合蛋白D(SP-D)O方法：取SD大鼠肺泡灌洗液,经TrisHC1EDTA法提取和maltoseagarose亲和层析法纯化SPD,用SDSPAGE电泳及SPD与幽门螺杆菌的玻片凝集试验鉴定。结果：从SD大鼠肺灌洗液中提取出较高浓度的蛋白，经SDSPAGE电泳检测，分子量约43kD,提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论：采用maltoseagarose亲和层析法可以从SD大鼠肺灌洗液中获得较高纯度的SPDo【关键词】肺泡表面活性物质相关蛋白质D；大鼠，SpragueDawley；组织提取物
2、；方法；生物学鉴定法[Abstract]Objective：ToisolateandpurifysurfactantproteinD(SPD)fromSDratbronchoalveolarlavageliquid.Metheds：SPDwereelutedfrombronchoaveolarlavagefluidofSDmicewithTrisHC1EDTA,purifiedbymaltoseagaroseaffinitychromatography,andthendeterminedbySDSpolyacrylamidegelelectrophresis(SDSPAGE)andagglut
3、inationtestwithHelicobacterpylori.ResuIts：SPDwithhighconcentrationwasobtainedbymaltoseagaroseaffinitychromatography.ThemolecularweightoftheobtainedSPDwas43kDa.Helicobacterpyloricouldbea.gglutinatedbytheprotein.Conclusion：HighlypureSPDcouldbeobtainedfromSDratbronchoalveolarlavageliquidbyaffinitychrom
4、atographyonmaltoseagarose・［Keywords］PulmonarysurfactantassociatedproteinsD；rats,SpragueDawley；tissueextracts；methods；biologicalassay肺表面活性物质结合蛋白D(SurfactantproteinD,SPD)是肺泡表面活性物质(PS)的重要蛋白成分之一［1］,在调节表面活性磷脂代谢和肺防御功能方面起重要作用［2］,临床上应用合成的肺表面活性物质治疗呼吸窘迫综合征、胎粪吸入综合征等肺部疾病［3］。1989年PerssonA等［4］通过高效液相色谱法，采用硫酸镁吸附，柠檬
5、酸钠洗提获得SPD,随着对其结构的深入研究，提取方法不断改进，1998年StrongP等［5］采用maltoseagarose亲和层析及Superose6凝胶过滤，提取到了高纯度的SPD。但由于Superose6柱价格昂贵，使该方法的应用受到限制。综合国外文献，删去Superose6柱的提取步骤，将洗提液进行调整，从SD大鼠肺泡灌洗液中进行SPD提取，并通过SDSPAGE电泳和与幽门螺杆菌的凝集反应对其性质进行了鉴定，报道如下。1材料与方法1.1实验动物及主要试剂SD大鼠（贵阳医学院实验动物中心）。maltoseagarose（sigma）,蛋白分子量标准，EDTA,叠氮钠，Tris,盐酸，C
6、aC12,甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铁，TEMED及考马司亮蓝等。幽门螺杆菌NCTC11637,获赠于中国疾病预防控制中心。1.2方法1.2.1鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的获取取清洁级SD大鼠9只，腹腔内注射20%乌拉坦0.5ml/100g,处死动物，固定、无菌操作分离出鼠肺，行气管插管后，用注射器注入15ml无菌生理盐水，轻拍双侧肺部,然后回收获取BALFo1.2.2SPD的提取将BALF配制成20mmol/LTrisHC1和10mmol/LEDTA,调节pH值为7.4,室温下搅拌1h,在4匸下10000g离心40min,取上清液配制成20mmol/LCaC12,重调pH至
7、7.4,得SPD粗提物。1.2.2SPD的纯化将1mlmaltoseagarose加入2ml无菌注射器(注射器内先放一张滤纸片)，制成层析柱，用含有10mmol/LCaC12,0.02%(W/V)叠氮钠，20mmol/LTrisHC1pH7.4的平衡缓冲液平衡层析柱。将SPD粗提物加入层析柱，滤过后用含1ininol/LNaCl、10mmol/LCaC12、0.02%(W/V)叠氮钠、20mmol
