单点突变蛋白特异的RNA适配体筛选及功能研究.pdf

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1、UniversityofScienceandTechnologyofChina博士学位论义论文题目单点灸交蛋合特异的度配体彿逸及功能研先作者姓名学科专业生物化学与分子生物学导师姓名单革敉援完成时间二—五年五肀函科嗲弑术大營博士学位论文单点突变蛋白特异的适配体筛选及功能研究作者姓名陈壳学科专业生物化学与分子生物学导师姓名单革教授完成时间二〇一五年五月七日UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationfordoctor'sdegreeTheisola

2、tionofanRNAaptamertargetingtop53proteinwithasingleaminoacidmutationAuthor'sName：：中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研宄工作所取得的成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人己经发表或撰写过的研宄成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：粋、签字日期：中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权

3、拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。▽公开口保密（年）作者签名：阳、导师签名：彳签字日期：：签字日期摘要摘要蛋白，也被认为是肿瘤的抑制蛋白。自从发现以来，被证实参与细胞周期调控，激活修复、维持基因组

4、稳定及促进细胞凋亡。在超过的人类的癌症中都出现功能缺失，其中就包括单位点和多位点的突变及结构的扭曲。同样也有越来越多的研宄证实，蛋白的突变，使得其空间构象发生变化，从而失去对细胞周期调控与促进细胞凋亡的重要生物学功能，与此同时，还会得到新的功能（如促进细胞转移、侵染等，由抑癌基因变为癌基因。目前越来越多的研究组开始关注蛋白突变体的研宄，其中就包括促进突变体的回复突变及抑制其生物学功能。此项研究对于癌症的靶点治疗具有重要的生物学研究与医学价值。核酸适配体（是一段短的单链核酸分子，其特点是能够根据结构特异性

5、针对性地地结合多种靶标分子，如蛋白质、小分子、糖、脂肪等。它是由一个口的体外筛选进程得到的。技术自从年由三个研宄组同时发明并已广泛地运用到诸如核糖体开关、靶向治疗等生物及医学应用。于是我们有理由相信，通过此筛选方法，我们也可以筛选到对诸如突变体有高亲和力和特异性的核酸适配体。目前，还未见研究组筛选到突变体适配体的报导。在本论文中，我们的首要研宄目的就是能够筛选到的适配体。由于此突变型与野生型的唯一区别只在于第位的氨基酸突变，所以我们对传统的筛选过程进行了改进，名为差别竞争筛选，将野生型与突变型蛋白质分别

6、经过固相偶联，同时投入体系中，竞争性地结合库分子，最大限度地增加筛选特异性与差异性。经过轮的差别竞争筛选，我们得到了个蛋白的候选适配体。通过亲和力检测，适配体与蛋白的亲和力大大超过对于野生型的亲和力，并且在凝胶迁移实验中我们最终确定能够在体外和结合。所以我们最终确定的作为我们后续研宄的对象。尽管在亲和力检测中，对于突变体有着相对于野生型较强的亲和力，但其细胞学效应还有待研究。在本论文中，我们试图阐述筛选到的适配体在细胞中的功能。首先，我们必须确定在其靶标的选择上具有严格的特异性。在含有野生型的和细胞中，

7、通过将转染入上述两种细胞中，无论从表型还是从细胞生长于凋亡的情况看，均没有发现与对照组有显著性差异。摘要同时，在只含有的另一个突变体的细胞中，经过转染，相对于对照组我们依然没有观察到明显的差别。在完成了以上实验证实对于含有野生型与其他突变体的细胞没有显著性作用之后，我们将此适配体构建到质粒并转染入稳转细胞系中，我们发现，经过处理的细胞，细胞增殖得到明显的抑制，细胞的死亡明显增多。而对于含有野生型的细胞，则没有此现象。侧面说明此适配体可以特异性地识别并显著影响细胞增殖与细胞凋亡。为了更加确定产生如此明显的

8、生物学差别与突变体相关，我们通过的免疫沉淀证实了在细胞中，与突变体结合的确大于和序列对突变体的结合能力。与此同时，通过克隆形成实验与实验我们证明了通过此适配体处理的细胞，其恶性程度与生长能力也有明显降低。由于很多的突变属于功能获得型突变，肿瘤细胞的迁移能力会不同程度地提高。为此我们设计了迁移实验和实验，证实经过此适配体处理过的细胞其迁移能力得到明显降低。进一步，在分子水平上，处理的细胞表现出更像野生型的调控方式，多个相互作用基因均有激活，一