柔嫩艾美耳球虫病毒RNA依赖性RNA聚合酶互作蛋白的筛选及功能研究

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1、本研究受国家自然科学基金（Nos.31272550,30970322和31272528）项目和吉林省科技发展计划（No.20170204036NY）项目资助Thisstudywassupportedbygrants(Nos.31272550,30970322and31272528)fromtheNationalNaturalScienceFoundationofChinaand(No.2017020436NY)fromJinlinKeyScientificandTechnologicalDevelopmentProgram,China中文摘要柔嫩

2、艾美耳球虫病毒RNA依赖性RNA聚合酶互作蛋白的筛选及功能研究柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）可以引起以出血和肠道溃烂为特征的鸡的球虫病，给养鸡业造成严重的经济损失。目前抗球虫药物和弱毒疫苗是控制球虫病的主要手段，然而球虫耐药性和活疫苗毒力反强等问题的出现阻碍了对球虫病的有效防治，其原因之一是人们对于鸡球虫的细胞及分子生物学特性的了解不够深入。许多原虫都含有双链RNA病毒，它们可以影响原虫的毒力或繁殖能力。有报道称携病毒E.tenella比不携病毒E.tenella对鸡的感染能力更强，而E.tenella病毒和E.tenella之间的关系目前

3、还不清楚。RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）是E.tenella病毒编码的一种具有复制和转录双重功能的蛋白。本研究利用酵母双杂交技术筛选出RDRP的互作蛋白OTU，并分析了其活性。另有报道称OTU是一种端粒相关蛋白且与端粒酶活性有关，故本研究又通过酵母双杂交和pulldown试验确定了E.tenella端粒酶逆转录酶RNA结合区（TRBD）和E.tenellaOTU蛋白的互作关系，并在此基础上探讨了OTU对端粒酶逆转录酶（TERT）活性的影响。主要研究内容如下：柔嫩艾美球虫病毒RDRP互作蛋白的筛选及鉴定：成功构建真核表达载体pGBKT7-RD

4、RP，并转化入酵母感受态Y187中。结果证实，RDRP诱饵蛋白可以在酵母菌中表达并且对酵母菌无毒性作用。通过α-半乳糖苷酶试验证实RDRP诱饵蛋白无自激活作用。通过酵母双杂交试验初步筛选到假设蛋白、核糖体蛋白、UncharacterizedACR和OTU-like半胱氨酸酶。α-半乳糖苷酶试验表明OTU与RDRP间存在相互作用。将RDRP和OTU分别克隆入pFast-Bac-HTA和pFast-Bac-dual载体中，并通过杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达并纯化。SDS-PAGE显示OTU以可溶性蛋白的形式表达，而RDRP以可溶及包涵体形式

5、表达。将His-RDRP蛋白，GST-OTU蛋白纯化后和GST琼脂糖凝胶树脂共孵育，pull-down试验证明两种蛋白存在相互作用。将表达有His-RDRP/GST-OTU蛋白的细胞裂解液、proteinA/G琼脂糖凝胶糖珠和His单抗共孵育进行免疫共沉淀试验，结果也表明RDRP蛋白与OTU蛋白的互作关系。RDRP对OTU去泛素化酶活性的影响：利用生物学预测OTU蛋白的去泛素化酶活性位点后，体外构建OTUC239A、OTUH351A、OTUD236A突变体，分别通过杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达并纯化OTU及其突变体蛋白，用K6-、K48-、

6、K63-、K11-、K29-、和K33-连接的二泛素检测OTU的切割特异性，并比较了OTU/RDRP复合物和OTU单体的去泛素化酶活性。体外试验验证，OTU可以水解K6-、K48-连接的二泛素链，但是不水解K63-、K11-、K29-、K33-连接的二泛素链，OTUC239A、OTUH351A突变体不具有E.tenellaOTU蛋白的去泛素化酶活性，而OTUD236A突变体具有E.tenellaOTU蛋白的去泛素化酶活性。当OTU和RDRP结合时，OTU对K48-和K6-连接的泛素链水解能力增强。柔嫩艾美球虫端粒酶和OTU蛋白的互作鉴定：成功构建

7、重组质粒pGBKT7-RDRP和pGADT7-OTU，共转入酵母感受态Y187中。酵母双杂交结果表明OTU与TRBD间存在相互作用。构建原核表达载体pET-32a-TRBD和pGEX-4T-1-OTU，并在大肠杆菌中进行原核表达和纯化。SDS-PAGE显示二者均能以包涵体及可溶性蛋白的形式表达。体外纯化His-TRBD和GST-OTU蛋白后和GST琼脂糖凝胶树脂共孵育，pull-down试验证明His-TRBD和GST-OTU是互作蛋白。OTU对端粒酶活性的影响：将针对OTUmRNA的锤头状核酶插入到E.tenella病毒载体中，构建了E.ten

8、ella病毒介导的锤头状核酶载体pEtV-GFP-Ham-OTU。体外切割试验表明pEtV-GFP-Ham-OTU体外转录体对OTU体外