柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究

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1、柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究ScreeningandIdentificationofproteininteractingwithtelomerasereversetranscriptaseanditsfunctionalstudiesinEimeriatenella作者姓名：赵娜专业名称：预防兽医学研究方向：动物及人兽共患寄生虫病指导教师：张西臣教授学位类别：农学博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年6月6日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位李祥

2、瑞教授南京农业大学主席李祥瑞教授南京农业大学索勋教授中国农业大学委员赵俊龙教授华中农业大学李国清教授华南农业大学宋铭忻教授东北农业大学胡敏教授华中农业大学赵权教授吉林农业大学于三科教授西北农林科技大学王放教授吉林大学刘明远教授吉林大学柳增善教授吉林大学本研究受国家自然基金项目资助（资助号Nos.31272550，30970322）ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.31272550,30970322).中文摘要柔嫩艾美耳球虫端粒酶

3、逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究艾美耳球虫作为细胞内寄生虫，寄生于鸡肠道内引起是由以肠道病变为主要特征的鸡球虫病并严重危害养禽业的发展。目前控制球虫病还是主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽的了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病的药物和疫苗。端粒酶及相关蛋白的发现为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。端粒酶作为一种核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒酶RNA和端粒酶相关蛋白三个亚单位组成，其以自身携带的RNA为模板，反转录合成

4、新的端粒DNA重复序列以维持染色体端粒的稳定性。而TERT是具有催化活性的亚单位。随着对端粒酶研究的深入，先后报道了多种端粒酶相关蛋白，并发现这些蛋白在端粒酶活性调节过程中起重要作用。应用酵母双杂交筛选到的hTERT互作蛋白p23，与Hsp90共同在端粒酶的高效组装和活化中发挥作用。PinX能与hTERT的RNA结合域（326~620aa）结合，并也能结合端粒酶RNA，在酵母中hPinX同源物是一个酵母端粒酶功能负向调节因子。四膜虫p65和p45作为端粒酶的一部分在端粒维持方面发挥必要的作用。目前，柔嫩艾美耳球虫（E.tene

5、lla）的TERT序列已经成功克隆出来，而端粒-like序列已被预测出来。这些表明E.tenella利用传统的端粒酶机制合成其端粒DNA维持染色体末端的稳定。但尚无TERT相关蛋白的报道。故本研究通过酵母双杂交筛选、pull-down以及免疫共沉淀技术鉴定TERT互作蛋白14-3-3，进而利用病毒载体介导的锤头状核酶探讨14-3-3在端粒酶调节中的功能。E.tenella酵母双杂交cDNA文库的构建：收集纯化E.tenella孢子化卵囊，Trizol提取总RNA并反转录成cDNA，使用SMART技术建立E.tenella酵母双

6、杂交cDNA文库。文710库滴度为5×10cfu/mL，容量为2×10cfu。随机挑选的48个克隆菌插入片段平均大小0.8~2kb，文库重组率高。E.tenella诱饵表达质粒pGBKT7-TRBD的构建及其互作蛋白的筛选：将PCR获得的E.tenellaTERTRNA结合域（TRBD）片段与诱饵载体pGBKT7连接构建重组质粒pGBKT7-TRBD，并转化入酵母感受态细胞中。结果表明，诱饵蛋白能在酵母菌中表达且对宿主菌无毒性作用。α-半乳糖苷酶试验表明诱饵蛋白无自激活作用。将IpGBKT7-TRBD/Y187与酵母双杂交cD

7、NA文库共培养筛选互作蛋白，初步筛选到了TRBD互作蛋白核仁素、14-3-3和尿苷磷酸化酶。α-半乳糖苷酶试验表明14-3-3与TRBD间存在相互作用。TRBD与14-3-3蛋白相互作用的鉴定：将TRBD和14-3-3基因分别克隆至原核表达载体pET-32a和pGEX-4T-1，并在大肠杆菌中进行原核表达和纯化。SDS-PAGE显示二者均能以可溶性蛋白的形式表达。将纯化的His-TRBD/GST-14-3-3共孵育，通过pull-down试验验证两种蛋白的相互作用。结果表明，E.tenellaTRBD蛋白与14-3-3蛋白在体

8、外具有相互作用。构建真核表达质粒pcDNA-3.1-Myc-TRBD和pcDNA-3.1-HA-14-3-3，共转染293T细胞，Westernblot显示Myc-TRBD和HA-14-3-3均能在293T细胞中表达。免疫共沉淀结果表明Myc-TRBD蛋白与HA-14-3-3