柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(etmic1)的克隆表达及功能初步研究

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1、河南农业大学硕士学位论文柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1（EtMIC1）的克隆表达及功能初步研究姓名：王园园申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：仝宗喜201205河南农业大学2012届硕士学位论文摘要鸡球虫病是严重危害养鸡业的一种寄生原虫病，目前对于鸡球虫病采用的免疫控制技术得到越来越多的应用。由于鸡球虫活卵囊疫苗完全以鸡体作为唯一制苗载体，普遍存在着弊端。因此，鸡球虫病的可持续控制期待着新型疫苗的研究开发。柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(micronemeprotein，MICI)基因是Tomley等人对柔嫩艾美耳球虫的大量的表达序列标

2、签(ExpressedsequenetagsESTs)作分析后，鉴定出的微线蛋白基因，研究认为其是参与球虫入侵宿主细胞过程中的一种重要蛋白，但是否能够对球虫产生免疫保护，以及其如何产生免疫应答，目前尚无确切的研究数据。我们根据GeneBank上报道的MICl基因序列，用RT．PCR技术克隆得到MICl基因序列。然后应用基因工程技术，将MICI基因序列以及该序列中的MICI粘附结构域(MICl．AD)分别克隆到原核表达载体pMAL-c2Xq]并转化入大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导表达重组蛋白。SDS—PAGE电泳显示，表

3、达的重组蛋白MICI和MICl．AD的分子量分别为116KDa左右和66KDa左右，与推导的氨基酸序列的大小相符。它们的IPTG诱导菌经超声波裂解破碎，SDS—PAGE结果表明，它们的火部分表达产物在裂解液上清中。按pMAL-c2X表达系统纯化操作手册，经AmyloseResin层析获得较高浓度的纯化重组蛋自。将制各好的pMAL．c2X．MICI、pMAL-c2X．MICI．AD重组蛋白按所设计的实验方案于7、14、21日龄分别三次经胸部肌肉注射免疫岭南黄鸡。28日龄经口感染3×104新鲜的E．tenella孢子化卵囊。35日龄扑杀

4、实验鸡，分别统计成活率、相对增重率等指标。动物实验结果表明：2种重组蛋白均能降低卵囊产量，减轻盲肠病变，证实了MICI．AD为MICl的主要功能区域。其中，高剂量重组蛋白免疫效果优于低剂量重组蛋白免疫效果。通过ELISA方法对免疫前、一免后、二免后、三免后及攻虫后7d的动物血清进行抗体效价的测定，利削荧光定量PCR方法对三免后鸡盲肠的IFN．n，IFN．D，IFN吖，TNF．n，lL一1p，IL．6，IL．12p40等7种细胞因子基因表达水平进行检测。结果显示高剂量免疫组产生了较高的抗体水平，且7种细胞因子的表达水平也明显高于阳性对

5、照组和阴性组，为进一步疫苗剂量的摸索提供理论数据，同时证明了EtMIC．1可以刺激动物机体相关免疫细胞分泌细胞因子，为研制鸡球虫基因工程疫苗奠定基础。关键词：Eimeriatenella；EtMICl基因；EtMIC．1．AD基因；重组蛋白；免疫保护河南农业大学2012届硕士学位论文Cloning，ExpressingandpreliminaryfounctionalstudiesofEimeriatenellamieronemeprotein1Supervisor：A．Prof．TongZongxiMasterCandidate：

6、WangYuanyuanABSTRACTEimeriatenellaisintracellularparasiteinthecaecumofdomesticchickencausingcoccidiosis，asevereinfectionparticularlyofpoultry．Conventionaldiseasecontrolstrategiesrelyheavilyonchemoprophylaxisand，toacertainextent，livevaccines．Duetotheincreasingemergencyo

7、fdrug—resistantstrainsandtheconsumers’needinggreenfood，manynovelmethodshavebeenexploredtocontrolthedisease．Thedecisivemeasureisusingtherecombinantvaccinesand／orDNAvaccinestocontroltheavaincoccidiosis．Amajorhurdleindevelopmentofthosevaccinesissearchingfortheprotectivean

8、tigens．Micronemeorganellesarepresentinallapicomplexanprotozoaandcontainproteinsthatarecriticalforparasitemotilityandh