鸡柔嫩艾美耳球虫etmic1和etmic2蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

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1、山东农业大学硕士学位论文中文摘要柔嫩艾美耳球虫是七种鸡球虫中致病力最强的虫种之一，寄生于盲肠中，危害十分严重。虫体顶复合器中含有多种具有分泌功能的细胞器。其中，微线细胞器分泌的EtMICl和EtMIC2蛋白在虫体粘附、入侵宿主细胞时起重要作用。目前研究表明EtMICl、EtMIC2蛋白具有较好的免疫保护力，相关报道称EtMICl、EtMIC2蛋白在球虫发育阶段的早期表达，但在其内生性发育的后期是否表达目前尚无报道。为了研究微线蛋白EtMICl、EtMIC2在球虫整个内生性发育阶段表达的动态变化，本研究进行

2、了以下工作：1．单克隆抗体的制备克隆了EtMICl、EtMIC2基因，利用原核表达的EtMICl、EtMIC2蛋白和本实验室保存的真核蛋白EtMICl、EtMIC2免疫BALB／c小鼠。免疫的BALB／c小鼠抗体效价达到单克隆抗体制备的标准后，经细胞融合、间接ELISA筛选、两次亚克隆获得稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。扩大培养收集细胞培养上清离心后作为单克隆抗体。结果得到了3组单克隆抗体。抗EtMICl原核蛋白的单克隆抗体：l-H2；抗EtMICl真核蛋白的单克隆抗体：1-A1、1-C4；抗EtMI

3、C2真核蛋白的单克隆抗体：9．B9、4-Cll。2．单克隆抗体的鉴定利用间接ELISA检测不同稀释度的单克隆抗体。结果显示l-H2、9-B9的效价为1：100，其它的效价为1：10稀释，这3组单抗的亚型均为IgGl。以间接免疫荧光技术定位本实验室酵母表面展示的EtMICl、EtMIC2蛋白和标记子孢子实验鉴定单抗。镜检均观察到荧光，子孢子进行westernblot印迹，与单克隆抗体作用(一抗)，DAB显色后分别得到了100KD和50KD左右的目的条带，大小与之前报道的相符。3．EtMICl、EtMIC2在

4、柔嫩艾美耳球虫整个内生性发育阶段表达的动态变化2周龄的鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫后，从90h开始杀鸡取盲肠，利用间接免疫荧柔嫩艾美耳球虫EtMICl和EtMIC2蛋白单克隆抗体的制各、鉴定及初步应用光技术两种单抗分别标记不同发育阶段的虫体和Westernblot方法双重检测EtMICl、EtMIC2蛋白在柔嫩艾美耳球虫配子体阶段的表达情况。利用间接免疫荧光技术，单克隆抗体与裂殖体、裂殖子、配子体作用后，镜下观察到荧光：对含有裂殖体、配子体的肠组织进行westernblot印迹，与单克隆抗体作用后(一抗)，分

5、别得到了100KD和50KD左右的目的条带，大小与理论值相符。结果显示，EtMICl和EtMIC2蛋白在柔嫩艾美耳球虫整个内生性发育阶段均表达。关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫；微线蛋白；单克隆抗体；配子体；间接免疫荧光Ⅱ山东农业大学硕士学位论文PreparationandInitialApplicationofMonoclonalAntibodiesthatRecognizetheEimeriatenellaMicronemeProteinIand2AbstractEimedatenellaisthestron

6、gestpathogenicityofsevenchickencoccidiosis，parasiticintheCeCUlIIofbirds，causingveryseriousharms．Itsapicalcomplexcontainsmanykindsoforgandiessecretion．Micronemeisorleamongthem．ThemicronemeproteinEtMIC1andEtMIC2secretedfromEimefiatenellamicronemeorganellesp

7、layallimportantroleintheparasiteadhesionandinvasionofhostcells．ResearchshowsthatEtMICI，EtMIC2proteinhasgoodimmuneprotectionagainstEimeriatenellainfection．NumerousstudiesdemonstratedthatboththeEtMIClandEtMIC2areimportantmicronemeproteinswhichareabundantlye

8、xpressedinsporozoitesandschizogouystages．ButtheexpressionofEtMIC1andEtMIC2inthegametogonystageisunknown．InordertostudythedynamicchangesofmicronemeproteinEtMIClandEtMIC2expressedinallthedevelopmentalstagesofEimeriate