柔嫩艾美耳球虫etgam22基因克隆表达及其免疫保护性研究

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1、曹李琴：柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因克隆表达及其免疫保护性研究!柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因克隆表达及其免疫保护性研究中文摘要鸡球虫病是危害养鸡业的重大疾病，其病原有7种，包括堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)、布氏艾美耳球虫(Ebrunetti)、巨型艾美耳球虫(Emaxima)、和缓艾美耳球虫(Emitis)、毒害艾美耳球虫(Enecatrix)、早熟艾美耳球虫(Epraecox)和柔嫩艾美耳球虫(Etenella)，其中Etenella的致病性最强。长期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下降。在鸡饲养周期中长期添

2、加药物导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向免疫预防。目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位疫苗两大类。虽然鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题，所以亚单位疫苗尤其是基因工程疫苗将成为最理想的鸡球虫病防治策略。Etgam22基因是Etenella在配子体阶段特异性表达的一种多拷贝基因，其表达产物与卵囊壁形成相关。尽管国外学者报道了该基因的序列，但该基因的

3、体外表达及其重组蛋白的免疫保护力等尚未见有报道。为此，本研究对Etenella配子体Etgam22基因进行了克隆和原核表达，对表达产物的免疫原性和鸡体免疫保护力进行了分析与评价，并对Etgam22基因在虫体体内表达定位和功能进行了探析，旨在为鸡球虫病基因工程疫苗的研制奠定基础。1柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因的克隆与序列分析从Etenella扬州株纯化的配子体中提取总RNA，经RT-PCR扩增出Etgam22基因片段。将目的片段插入到pGEM．T-Easy载体，常规转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，蓝白斑筛选后，对经酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果显示，克隆的Etgam2

4、2基因全长为749bp，具有一个大小为597bp的完整开放阅读框，与E．tenellaVT-2株Etgam22基因序列比较，同源性为99．6％。编码198个氨基酸。用PredictingAntigenicPeptides预测软件分析Etgam22基因编码区的抗原性，显示存在4个抗原决定簇，其中脯氨酸．组氨酸富集区含有3个抗原位点。2柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因的原核表达根据Etgam22基因的ORF序列和质粒pET-28a(+)酶切位点设计引物，以重组质粒pGEM．T-Easy-gam22为模板扩增出表达片段，大小为558bp。将该基因片段与载体pET-28a(+)连接，构建重组表

5、达质粒pET-28a-gam22。转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞扬州大学硕士学位论文后，经过IPTG诱导，融合蛋白在大肠杆菌中成功表达。表达产物主要以包涵体形式存在，大小约为23．8kDa。分别以鼠抗重组蛋白EtGAM22多克隆抗体和Etenella鸡康复血清为一抗进行Western．blot检测，结果显示重组蛋白具有免疫原性；分别以毒害艾美耳球虫(Enecatrix)和巨型艾美耳球虫(Emaxima)的康复血清为一抗进行Westem．blot检测，显示重组蛋白具有一定交叉免疫原性。间接ELISA方法检测鼠抗重组蛋白EtGAM22多抗和鸡康复血清，显示体外重组蛋白能被感染Et

6、enella的鸡阳性血清识别，并能刺激机体产生较高的抗体水平。3柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因表达产物的体内定位7周龄黄羽肉鸡人工感染Etenella扬州株后120h、132h、144h、156h、168h、180h分别扑杀取盲肠组织，制作石蜡组织切片。进行HE染色和以鼠抗重组蛋白EtGAM22多抗为一抗的免疫荧光组织化学染色，分别用生物光学显微镜和荧光显微镜观察。结果显示：感染后132h盲肠绒毛上皮细胞内存在大量配子体及少量近成熟的卵囊，在大配子体的成壁体和卵囊壁上有荧光标记。结论：Etgam22基因表达产物主要存在于大配子体的成壁体内，并参与卵囊壁的形成；本研究所克隆的基因确实为

7、配子体蛋白基因。4柔嫩艾美耳球虫重组蛋I刍EtGAM22的免疫保护效果以黄羽肉鸡为试验动物，以平均增重、相对增重率、病变记分与卵囊减少率等为评价指标，对重组蛋白的免疫保护效果进行了初步研究，并对其诱导的特异性免疫应答水平进行了检测。结果显示：重组蛋白免疫后均能诱导～定的细胞免疫和体液免疫水平，抗体水平、CD4+水平、CD8+水平等免疫指标均高于未免疫未攻虫组：与未免疫未攻虫组相比，重组蛋白免疫组在一定程度上能提高增重，降低病变记分和减少卵囊产量