巨型艾美耳球虫emgam56基因在毕赤酵母中的表达及其免疫保护性研究

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2、非主’一金＇＇－．？、心；－－－巧泉Ｋ邓长静心—該气＇’一一、＾．、－＾，禾‘／，私－指导教师姓名：陶建平教授亡气，．，扬州大学，江苏扬州，２２５００９！１＾申请学位级别：硕壬学科专业名称：预防善医學论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期；２０１５年６月―奇学位授予单位：扬州大学学位授予日期：．：争ｔ：＾答辩委员会主席：＾＾或、嗦扳怒貞？？，．＊，‘、＾－聲义、如榮二＾，、＾如之違軒汚？，Ｃ叛户之邊岭１．．一輸：一：六讀霸邓长静：巨型艾美耳球虫基因

3、在毕赤酵母中的表达及其免疫保护性研巧１＿巨型艾美耳球虫基因在毕赤醇母中的表达及其免疫保护性研究中文摘要一鸡球虫病是由多种艾美耳球虫（投ｗｅＷａ）寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞内所引起的种寄生原虫病，不仅引起鸡发病死亡，还可严重影响鸡的生长发育，降低饲料报酬。目前鸡球虫病的防治主要依靠化学药物，其次是鸡球虫病活疫苗。随着抗球虫药物的广泛与大量使用，球虫耐药性Ｗ及人们对药物残留肉蛋、污染环境等诸多问题也随么出现。同时活球虫疫苗又存在生产成本高、容易扩散病原、容易引起肠炎发生等弊端。为此，亚单位疫苗？己成为鸡球

4、虫病疫苗的发展方向。ＣｏｘＡｂｉｃ是由巨型艾美耳球虫（丘ｗａｘ加ａ）配子体蛋白ＥｍＧａｍ５６一、ＥｍＧａｍ８２和ＥｍＧａｍ２３０组成的种亚单位疫化在其生产过程中需从感染鸡体分离纯化配子体，然后再用亲和柱层析的方法分离纯化配子体蛋白，因此生产费时、成一本昂贵。利用基因重姐技术研制基因工程疫苗可能解决这难题。己斯德毕赤酵母表达系统是一种真核表达系统，不仅具有操作简单、生长速度快、发酵成本低廉等优点，还具有高等真核表达系统的蛋白翻译后的加工修饰功能，该系统所表达产物的免疫学活性和生物学功能与天然蛋白质更为接近。因此，本研

5、充在己斯德毕赤酵Ｍ母中表达了ｗａｘ如ｆ配子体蛋白基因，检测了酵母表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６的抗原特异性和免疫原性，并通过动物免疫保护试验比较分析了酵母表达蛋白ｒＥｍＧａｍＷ和原核表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６对怎．ｗａｘ細０的免疫保护效果，为重姐配子体抗原亚单位疫苗的研制奠定基础。１．巨型艾美耳球虫Ｅｍｇａ／Ｍ５６基因的毕赤酵母表达及其巧步鉴定根据Ｅｍｇｆｌｗ％基因去除信号化后的ＯＲＦ序列和真核表达载体ｐＰＩＣｚａＡ的酶切位点设一－计对特异性引物ＧＥＭＴ－Ｅｍａｗ５６为Ｃ民扩增出，Ｗ本实验室保存的重组质粒ｐｇ模板

6、，ＰａＡ－目的片段，插入表达载体ｐＰＩＣｚ中，构建重组表达质粒ｐＰＩＣｚａＡＥｍｇｏｗ５６。对酶切鉴定和ＰＣＲ鉴定为阳性的重组质粒进行测序，将连接正确的重组质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母ＧＳ１１５，利用博莱霉素（Ｚｅｏｃｉｎ）抗性筛选多拷贝重组菌株，摇瓶水平进行诱导表达，所得蛋白大小约为１１．６ｋＤａ，且能被６ＸＨＩＳ单抗识别。２．巨型艾美耳球虫毕赤酵母重组表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６的免疫原性分析ｎ扬州大学硕±学位论文分别Ｗ鼠抗醇母表达蛋白ｒＥｍＧａｎｉ５６多克隆抗体、鼠抗原核表达蛋白正ｍＧａｍ５６多克

7、一－．抗隆抗体和左ｗａｘ加＜３鸡康复血清为，对酵母表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６进行Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ检额！Ｉ，结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。Ｗ酵母表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６为抗原，用间接化ＩＳＡ方法检测鼠抗酵母表达蛋白正ｍＧａｍ５６多抗、原核表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６多抗和鸡康一复血清，显示该重组蛋白能刺激机体产生定的抗体水平，并且能识别鸡康复血清中的特异性抗体。义巨型艾美耳球虫毕节酵母重组表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６的免疫保护效果、、、维鸡为试验动物，Ｗ死亡率相对增重率病变记分减少率与相对卵囊产量细胞免疫和体液

8、免疫水平等为评价指标，对酵母表达蛋白ｒＥｍＧａｍ５６的免疫保护效果进行了初ｒＥｍＧａ５６；步研究，并与原核表达蛋白ｍ和卵囊的免疫效果相比较。结果显示酵母表达蛋白高剂量组（６０ｎｇ／羽