酪蛋白源新型抗高血压活性肽的分离、纯化与其生理活性和结构鉴定

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1、上海交通大学博十后报告酪蛋白源新型抗高血压活性肽的分离、纯化及其生理活性和结构鉴定摘要近年来，随着人们生活水平的提高大约有20％的成年人受此威胁，因此，加引起广泛关注。高血压的发病率也呈上升趋势，全世界源于食品抗高血压肽的保健功能研究愈酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，结构比较开放、松散，易受多种蛋白酶的作用而发生水解。本实验选用食品级微生物蛋白酶A和B分别水解酪蛋白，而且水解时产生较多的切割位点，可以达到较高的水解度。通过改变酶的浓度进行水解，水解效果较好，水解度达到20％以上，水解后形成的肽段的平均含有2—5个氨基酸残基，但水解后样品中的灰分含量较高，一般为

2、14％左右，严重影响了水解样品的品质和活性的分析研究，必需进行脱盐处理。同时水解物进行RP．HPLC分布的结果显示酪蛋白水解后形成很多肽的混合物，成分复杂，需要进一步分离纯化。采用大孔吸附树脂对蛋白溶液进行脱盐处理行之有效的方法。本实验通过筛选利用DA．201C对酪蛋白酶解液的脱盐是最佳的，而且70％乙醇溶液为洗脱剂时洗脱率和脱盐率均较高，而且水解样品经脱盐处理后大部分的ACE抑制活性升高，特别是8号样品脱盐后的活性升高幅度较大，达到80I％，并且RP—HPLC检测，脱盐后达到了脱盐和纯化的目的，但是其中的成分还是很复杂。利用8号脱盐样品两种浓度(高剂量1

3、000m∥kg；低剂量500mg／kg)对SHR大鼠灌胃，6小时内降压效果强烈；1000mg／kg的剂量对SHR大鼠有极显著的降压效果，500mg／kg的剂量亦对SHR大鼠有显著的降压效果。因此8号脱盐样品在体外有较强的ACE抑制活性，在体内动物实验也具有较强的抗高血压活性，表明脱盐后样品为含有抗高血压活性肽的混合物。采用分子排阻的凝胶色谱、RP．HPLC方法对8号脱盐样品进行分离纯化，经SephadexG一15分离后显示6个分离组分峰，并分别为I、II、III、Ⅳ、V、Ⅵ，其中8一V和8一Ⅵ组分具有较强的ACE抑制率，分别达到72．6％和75．5％，因此

4、将对8一V和8一Ⅵ作进一步分析与分离。经RP．HPLC检测分析，8一Ⅵ组成成分复杂，而8一V峰样品在检测波长220rim和280nm都显示主要两个组分峰，分别为P1和P2，其氨基酸组成中含有芳香族氨基酸。检测P1和P2组分对ACE活性抑制率，分别达到84．4％和79．6％，采用RP—HPLC检验纯化效果，这两个组分都只含有一种肽。在体外检测活性的基础上，采用8一V号样品((5mg／mL)对SHR大鼠灌胃(<5mg／kg)，测量同一天不同时间点大鼠的SBP,在4小时和8小时内降压效果强烈，以后大鼠血压渐渐升高趋势，8一V号样品在连续9天灌胃SHR大鼠后卜海交

5、通大学博士后报告SBP的的测量结果，统计结果样品组和对照组比较有极显著差异(P<0．01)，说明8一V所含有的两个组分Pl和P2是具有较强作用的抗高血压活性肽。采用LC—ESI．MS对8．V样品进行分子量和序列的初步分析，在此基础上又通过MALDI．TOP—TOP—MS和N一端氨基酸序列仪对8一V—P1和8一V—P2进行分子量和序列的进一步确定，8一V样品进入HPLC分离结果，主要峰为P1和P2，分别选择Pl和P2进行质谱鉴定和高级分析软件Biolynx分析，软件推导氨基酸序列P1为A1一A2；P2为Bl—B2一B3或C1一C2．C3一C4，经过与酪蛋白序

6、列比对，序列C1一C2一C3一C4在CN中不存在。进一步通过MALDI．TOP—TOP—MS和N一序列检测结果与分析得出8一V—Pl为A1一A2，8一V—P2为B卜B2一B3，利用生物信息学网上查找和大量资料的查阅对比，没有找到序列相同的抗高血压肽，因此该两种肽为新型抗高血压肽。总之，本研究以酪蛋白为原料通过微生物蛋白酶降解后，分离纯化得到两种新型抗高血压活性肽，同时建立体内和体外功能检测模型跟踪其对ACE抑制活性和抗高血压效果，并进行多肽的分子量和一级结构的测定，为食品蛋白质的开发利用和多肽药物的研究奠定理论和实验依据。关键词：酪蛋白抗高血压活性肽纯化生

7、理活性结构检测AbstractSeparation，PurficationandIdentificationofAntihypertensiVePeptidesfromCaseinABSTRACTCasein，withessentialaminoacidforindividualgrowth，isthemostabundantproteininmilk．Recently,manyresearchesdemonstratedthatcaseinwasnotonlysourcesofnutrients，butmayalsobeonesofbiologicall

8、yactivepeptides，amongwhichACEinhi