稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的hepg2细胞克隆的建立

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1、稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立雷迎峰，尹文，薛小平，杨敬，吕欣，韦三华，胡兴斌，孙梦宁，徐志凯【关键词】丙型肝炎病毒EstablishmentofstablytransfectedHepG2celllineexpressingHCVscNS4A/NS3protease　　【Abstract】AIM:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorofHCVsinglechainserineprotease(scNS4A/NS3)andtoobtainitssta

2、blytransfectedHepG2cellline.METHODS:AccordingtothesequenceofHCVscNS4A/NS3genefromtheliterature,theprimersamplifyingthegenecodingscNS4A/NS3proteasetheHCVpositiveserumandthegenecodingscNS4A/NS3proteaseplifiedviaRTPCR.ThePCRproductHⅠ/HindⅢandpurifiedbygelextraction.

3、ThisfragmentedintoE.coliJM109.Thepositiverebinantplasmidedigestion.TherebinantplasmidantsedpcDNA3.1(-)scNS4A/NS3entofcellbasedsysteminevaluatingantiHCVserineproteasedrug.　　【Keyine,transfection;colonecells　　【摘要】目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的Hep

4、G2细胞克隆.方法：根据文献报道设计扩增scNS4A/NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RTPCR方法扩增出scNS4A/NS3基因片段，BamHⅠ/HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)，转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3.1(-)～scNS4A/NS3，经酶切鉴定及序列测定.将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RTPCR，IFA，109菌株、pcDNA3.1(-)质粒由本室保存.

5、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶BamHI，HindⅢ等购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自Vgene公司，T4DNA连接酶购自上海生物工程公司，FITC和HRP标记羊抗鼠IgG,DNA分子标准、低分子蛋白质标准分别购自华美生物工程公司.反转录试剂盒SuperscriptⅡ，Trizol，Lipofecatmine2000，G418购自Gibco公司.NS3mAb由本室制备〔3〕.　　1.2方法　　1.2.1HCVRNA的提取与cDNA第一链的合成以HCV阳性患者的血清为材料提取病毒RNA，方法参照Trizol说明书，

6、将RNA沉淀溶于20μL不含RNase的去离子水.反转录按SuperscriptⅡ说明书进行，模板为病毒RNA，反转录引物为scNS4A/NS3基因下游引物，最后获得cDNA第一链.1.2.2scNS4A/NS3基因的PCR扩增　　1.2.5稳定转染细胞系的检测①RTPCR检测稳定转染细胞中目的基因的mRNA：将稳定生长的细胞用PBS清洗一次后，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，按SuperScriptTMII反转录试剂盒（Gibco公司）操作说明进行.用P1和P2对反转录产物进行P

7、CR.PCR反应体系及反应条件同前.②免疫荧光检测：用胰蛋白酶消化稳定生长的细胞，吹匀，将之加入镀膜片小孔中，每孔15μL，置于湿盒中，37℃,50mL/LCO2培养箱培养12h，40g/L多聚甲醛固定，NS3mAb作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，500g/L的甘油封闭后在荧光显微镜下观察.同时以转染空质粒pcDNA3.1（-）的HepG2做为对照.③r22000）处有一特异条带.而转染空质粒pcDNA3.1(-)的HepG2细胞没有染出条带(图3).　　3讨论　　HCVNS3蛋白编码基因全长共1893个核

8、苷酸.NS3蛋白近N端1/3(1～180aa)具有丝氨酸蛋白酶活性.近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPpase)和解旋酶(Helicase)活性〔6〕.NS3丝氨酸蛋白酶在四个连接区域切割多聚蛋白前体：NS3／NS4A，NS4A／NS4B，NS4B／NS5A，NS5A／NS5B.随着NS3丝氨酸蛋白酶得到表达和纯化