稳定表达hpv16 e6 sirna细胞克隆的建立

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1、稳定表达HPV16E6siRNA细胞克隆的建立【摘要】目的构建针对HPV16E6基因的逆转录病毒载体，感染HPV16阳性宫颈癌细胞，筛选稳定表达HPV16E6siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体，脂质体法将逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，收集病毒上清，感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16E6siRNA细胞克隆，RTPCR检测细胞中E6mRNA表达，细胞增殖实验检测细胞增殖

2、力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆，病毒感染靶细胞SiHa后，筛选出稳定表达HPV16E6siRNA的细胞克隆，RTPCR示HPV16E6mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16E6siRNA细胞克隆，特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16E6mRNA表达，HPV16E6siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。【关键词】RNA干扰DNA探针HPV宫颈肿瘤克隆细胞［ABSTRACT］ObjectiveToconstructarebinantdefectivev

3、ectortargetingHPV16E6gene，transfectintotheHPVpositivecervicalcarcimonacellsandselectclonecellsidusingliposomebasedtransfectionmethodandthestableintegrantessengerRNA(mRNA)expressioneasuredbeforeandafterthetransfectionbyproliferationassayandreversetranscriptasepol

4、ymerasechainreaction,respectively.ResultsTheSiHacellsthatstablyexpressedE6siRNARNAlevelarkably.TheproliferationonstratesinhibitoryeffectoncellgroRNAexpression.ThisstudyindicatesthatsiRNAHPV16E6canbeusedasanoveltherapeuticapproachforcervicalcancer.［KEYMELKAMP等[4]学者

5、构建了指导siRNA体内转录合成的pSUPER质粒载体，其诱导的基因沉默效应稳定而持久，具有可用抗生素筛选等优点。本实验采用pSUPER载体，成功构建了抑制HPV16E6基因表达的逆转录病毒载体，获得了载体稳定整合入基因组、稳定表达E6siRNA的细胞克隆，为进一步探讨E6基因沉默后HPV阳性宫颈癌细胞的生物学性状，以及RNAi技术在治疗宫颈癌中的应用提供了实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞系和质粒本文SiHa细胞系购自中国典型培养物保藏中心；包装细胞PA317、大肠杆菌E.cdiJM109细菌由青岛大学医学院

6、微生物学教研室提供；pSUPER.retro.neo+gfp质粒购自美国OligoEngine公司；靶向E6基因的寡核苷酸由美国OligoEngine公司合成；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶均购自大连宝生物有限公司；转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogene公司；Polybrene、DEPC购自SIGMA公司；G418、逆转录试剂盒、PCRMarker、PCR反应体系、电泳缓冲体系购自美国Promega公司；TRIZOL购自美国

7、GIBCO公司。1.2方法1.2.1靶向E6基因寡核苷酸的设计应用美国OligoEngine公司提供的siRNA设计软件，将E6基因序列号AF404706输入后，该序列即自动选择19nt的靶序列，其靶序列如下：5′AGCAACAGTTACTGCGACG3′。由OligoEngine公司合成60nt两条互补单链，黑体字序列即为19nt的靶序列，中间为9nt的spacer区相隔，两端为保护碱基及HindⅢ和BglⅡ酶切黏性末端。1.2.2逆转录病毒载体的构建选择OligoEngine公司的pSUPER.retro.neo+

8、gfp质粒作为载体。将合成的两条寡核苷酸片段溶于无菌无核酸酶的水中，终浓度为3g/L,各取1μL加入48μL退火缓冲液中，按照下列条件进行退火反应：94℃4min,80℃4min,70℃10min,37℃20min,最终缓慢冷却到室温。分别用HindⅢ和BglⅡ双酶切的pSUPER.retro载体，先加